劉晶晶，郭瑩瑩，李艷琪，王文文，吳祖澤，靳繼德

1.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100022；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300072

畢赤酵母不但具有繁殖快、易培養(yǎng)、培養(yǎng)基廉價(jià)和試驗(yàn)過程簡單可行等優(yōu)點(diǎn)，而且具有強(qiáng)啟動子、可以對外源蛋白進(jìn)行加工折疊和翻譯后修飾的特點(diǎn)，因此具備了典型的真核生物表達(dá)體系的條件。畢赤酵母已發(fā)展成一個較為理想的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)外源蛋白和生物制品，已有1000多種外源蛋白在畢赤酵母中獲得表達(dá)[1]。目前，生物制品的生產(chǎn)大都借助原核或真核表達(dá)系統(tǒng)，但表達(dá)系統(tǒng)宿主又會帶來一定的安全性問題，因此這些生物制品必須符合嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。宿主菌殘留的DNA是此類產(chǎn)品中特有的潛在致癌性雜質(zhì)，這些產(chǎn)品中外源性DNA殘留量的控制是一個非常重要的指標(biāo)[4-5]?！吨腥A人民共和國藥典》對生物制品中宿主DNA的殘留量有明確規(guī)定，即原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的產(chǎn)品，DNA殘留量標(biāo)準(zhǔn)是每人份不超過10 ng，真核細(xì)胞生產(chǎn)的產(chǎn)品其含量應(yīng)不高于每人份100 pg，酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的產(chǎn)品其含量不高于每人份10 ng[6]。酵母屬真核生物，所以應(yīng)制定更為嚴(yán)格的DNA殘留量質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以提高產(chǎn)品的安全性。藥典推薦使用的外源DNA殘留檢測方法有斑點(diǎn)雜交法和熒光法。DNA雜交法實(shí)驗(yàn)操作周期長，步驟煩瑣，干擾因素多，重復(fù)性差，且不能進(jìn)行定量分析[7-8]，一次檢測的樣本量也比較有限。熒光法的檢測靈敏度較低，檢測范圍為1～80 ng/mL。此外，針對DNA重組藥物中殘留的宿主DNA含量的測定方法還有基于DNA結(jié)合蛋白的Threshold Immuno?assay分析系統(tǒng)[9]及實(shí)時定量PCR法[10]。實(shí)時定量PCR（real-time PCR）技術(shù)自從1993年問世以來，就以其準(zhǔn)確、靈敏度高、便捷、低污染等特點(diǎn)而被廣大科研工作者廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原物和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測等方面[11-13]。它既保持了PCR技術(shù)靈敏、快速的特點(diǎn)，又克服了以往PCR技術(shù)中存在的假陽性污染和不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)，還具有重復(fù)性好、省力、低費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)[14]。在本研究中，我們建立了基于SYBR GreenⅠ熒光染料的實(shí)時定量PCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)了對重組產(chǎn)品中畢赤酵母DNA殘留量的快速、簡便、高靈敏度的定量檢測，可用于重組新蛭素等生物制品制備過程中的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料

畢赤酵母菌GS115為本室保存；5批注射用重組新蛭素為本實(shí)驗(yàn)室制備，均為畢赤酵母菌GS115表達(dá)生產(chǎn)的生物制品。SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）購自大連TaKaRa公司；PrepSEQ殘留DNA提取試劑盒購自北京東方嘉誠科貿(mào)有限公司；酵母基因組提取試劑盒購自Promega公司；溶細(xì)胞酶（lyticase）購自天根生化科技公司；全自動熒光定量PCR_LightCycler480系統(tǒng)為Roche公司產(chǎn)品。

1.2 檢測基因與擴(kuò)增引物

選擇畢赤酵母基因組中拷貝數(shù)高、染色體中分布廣的5S rRNA基因作為擴(kuò)增的目的基因，根據(jù)re?al-time PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物Primer 5S-sense（5'-GGTTGCGGCCATATCTAG-3'）和 Primer 5S-antisense（5'-AGATTGCAGCACCTGA GT-3'）[15]，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3 宿主菌基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取畢赤酵母500 μL接種于100 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至D600nm約為1.5，離心收集菌體，加入山梨醇緩沖液（0.12 mol山梨醇，用pH7.4的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液定容至100 mL）300 μL、溶細(xì)胞酶（10 U/μL）10 μL，37℃搖床溫育60 min，冷卻至室溫，離心棄上清，用酵母基因組提取試劑盒提取宿主菌DNA，分別用異丙醇沉淀和70%乙醇洗滌去掉酵母基因組DNA中的脂溶性物質(zhì)，最終得到的沉淀加入50 μL無菌水和1.5 μL RNase，37℃溫育15 min，65℃溫育1 h或4℃過夜，得到酵母基因組DNA，保存在-20℃，用紫外分光光度法測定濃度及D260nm/D280nm值。

1.4 real-time PCR檢測畢赤酵母DNA殘留量方法的建立

將基因組DNA稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（1000、100、10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4pg/μL），取10 μL基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以Prim?er 5S-sense和Primer 5S-antisense為引物，在全自動熒光定量PCR_LightCycler480系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時檢測熒光強(qiáng)度。real-time PCR反應(yīng)體系包括SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）（2 ×）12.5 μL、引物（10 μmol/L）各 0.5 μL、基因組 DNA標(biāo)準(zhǔn)品 10 μL、無菌 ddH2O 1.5 μL（DNA 聚合酶、PCR緩沖液、dNTP及SYBR GreenⅠ均已事先混合于商品化的SYBR Premix Ex Taq中）。經(jīng)過優(yōu)化的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min激活Taq聚合酶，95℃變性5 s、55℃退火15 s、72℃延伸15 s，循環(huán)70次，55～95℃程序升溫檢測熔解曲線，進(jìn)行熒光檢測。

1.5 精密度和回收率測定

將1000 pg/μL的標(biāo)準(zhǔn)品DNA用滅菌注射用水稀釋至1 pg/μL，平行做8孔，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的精密度測定；同時取供試樣品稀釋至20 mg/mL，平行做3孔，測定樣品的精密度。為了測定DNA標(biāo)準(zhǔn)品在樣品中的加樣回收率，先用滅菌注射用水將樣品溶液稀釋至20 mg/mL，然后將標(biāo)準(zhǔn)品DNA分別稀釋至1、1×10-1和1×10-2pg/μL，分別取5 μL標(biāo)準(zhǔn)DNA再加5 μL樣品溶液作為待測樣品1、2和3，每個濃度平行加樣3孔，進(jìn)行PCR反應(yīng)，測定加樣回收率。用全自動熒光定量PCR_LightCycler480系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析結(jié)果。用下式計(jì)算DNA加樣回收率。為了減少待測樣品中的高濃度蛋白對PCR結(jié)果的干擾，應(yīng)用DNA純化回收試劑盒對DNA樣品進(jìn)行回收，觀察回收對DNA含量測定的影響。

1.6 重組新蛭素制品中DNA含量的測定

根據(jù)每人次用劑量（20 mg），將所有供試樣品均稀釋到20 mg/mL進(jìn)行測定，再利用回收率校正計(jì)算樣品DNA殘留量，用下式計(jì)算（x代表標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)值，即樣品濃度的對數(shù)）。

2 結(jié)果

2.1 宿主菌基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備結(jié)果

利用紫外可見分光光度計(jì)檢測酵母基因組DNA，以去離子水為空白對照，測得DNA濃度為527 μg/mL，D260nm/D280nm值為1.824。

2.2 real-time PCR定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1為1×10-4～1000 pg/μL的標(biāo)準(zhǔn)品DNA realtime PCR擴(kuò)增曲線。可以看出1×10-1～1000 pg/μL標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線平穩(wěn)光滑，峰值較高，沒有雜合的基因片段，且指數(shù)增長期、線性增長期及平臺期呈現(xiàn)明顯的“S”型曲線，標(biāo)準(zhǔn)品DNA擴(kuò)增效率較高。而標(biāo)準(zhǔn)品低于1×10-2pg/μL時，雖然也可獲得較好的擴(kuò)增曲線，但重復(fù)性和擴(kuò)增效率明顯降低，而且當(dāng)選取DNA濃度為1×10-2～1000 pg/μL制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的誤差值為0.271，大于0.2；選取DNA濃度為1×10-1～1000 pg/μL制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的誤差值為0.197。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-5.055，截距為29.85，擴(kuò)增效率為1.577。圖2為實(shí)時熒光定量PCR的熔解曲線，可以看出DNA濃度為1×10-1～1000 pg/μL時可檢測到單一明顯的特異峰值，且無非特異性擴(kuò)增雜峰及引物二聚體的低矮小峰出現(xiàn)，證明了產(chǎn)物的特異性。當(dāng)濃度低于1×10-2pg/μL時，熔解曲線明顯變得低矮，且形態(tài)發(fā)生了變異。PCR結(jié)束后，用PCR_LightCycler480系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖3為標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品濃度與循環(huán)閾值（Cp）之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式為Cp=-5.055x+29.85（x是標(biāo)準(zhǔn)品濃度取對數(shù)后的值），從儀器讀取待測樣品的Cp值，然后把待測樣品的Cp值代入線性方程，就可以得到x值，算出其初始濃度。

圖1 real-time PCR擴(kuò)增曲線

圖2 熔解曲線

2.3 精密度測定結(jié)果

DNA標(biāo)準(zhǔn)品含量為1 pg/μL時的精密度測定結(jié)果見表1，Cp值的RSD為3.09%，標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果平均值為0.71 pg/μL，RSD為48.39%。測定供試樣品DNA殘留量精密度結(jié)果見表2，平均值為2.7×10-4pg/μL，RSD為25.0%。

2.4 回收率測定結(jié)果

畢赤酵母DNA加樣回收率測定結(jié)果見表3，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1×10-2～1 pg/μL時的回收率為32.4%～80.0%。對濃度分別為100、10和1 pg/μL的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)DNA純化試劑盒純化后進(jìn)行回收率測定，結(jié)果見表4，標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過純化后的回收率較低，原因可能是部分DNA在純化操作過程中損失了。

2.5 供試樣品DNA含量測定結(jié)果

圖3 real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 用標(biāo)準(zhǔn)品測定精密度

表2 用供試樣品測定精密度

5批注射用重組新蛭素（酵母）外源DNA殘留量測定結(jié)果見表5。根據(jù)真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品對宿主DNA殘留量的標(biāo)準(zhǔn)，每劑量蛋白質(zhì)產(chǎn)品中DNA殘留量應(yīng)小于100 pg。注射用重組新蛭素的包裝規(guī)格為20 mg/支，使用方法是用1 mL注射用水溶解后靜脈滴注。因此，注射用重組新蛭素中畢赤酵母DNA殘留量應(yīng)小于0.1 pg/μL。依據(jù)加樣回收率測定結(jié)果，當(dāng)DNA含量約為0.1 pg/μL時回收率為50.0%，因此，為增加樣品測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，測定結(jié)果用標(biāo)準(zhǔn)品回收率校正計(jì)算樣品DNA的殘留量。5批重組新蛭素（酵母）外源DNA殘留量分別為0.03、2.3、0.2、0.6和0.2 pg/mg，換算成每劑量依次為0.6、46、4.0、12、4.0 pg，均遠(yuǎn)小于每人份劑量100 pg的要求。

表3 加樣回收率測定

表4 標(biāo)準(zhǔn)品純化后的回收率測定結(jié)果

表5 注射用重組新蛭素DNA含量測定結(jié)果

3 討論

與斑點(diǎn)雜交法相比，實(shí)時定量PCR法檢測DNA具有操作簡便、周期短、可定量分析等優(yōu)點(diǎn)；與熒光法相比，具有更高的靈敏度，檢出限可達(dá)1×10-1pg/μL水平。而且采用實(shí)時定量PCR法可在短時間內(nèi)（30 min～2 h）完成對多個樣本的檢測，是高通量快速定量檢測宿主基因組DNA殘留的理想方法[16]。

畢赤酵母5S rRNA具有21個拷貝，分布于全部的4條染色體上，高拷貝數(shù)的特點(diǎn)使其很容易被檢測到，而分布的廣泛性使其即使在基因組不完整的情況下也能被檢測到，因此，5S rRNA基因適宜作為酵母DNA殘留檢測的目標(biāo)基因[15]。

實(shí)時定量PCR技術(shù)應(yīng)用了熒光染料或探針來保證擴(kuò)增的特異性，熒光信號的強(qiáng)弱同擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比，從而實(shí)現(xiàn)了真正意義上的定量檢測。SYBR GreenⅠ熒光染料無特異性，只要是雙鏈就會結(jié)合，對PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會結(jié)合產(chǎn)生熒光，相對于TaqMan探針法，通常本底較高，精確度稍差。但SYBR GreenⅠ能夠與所有雙鏈DNA結(jié)合，因而對不同模板不需要定制不同的特異性探針，其通用性較好，而且價(jià)格相對較低，適合作為常規(guī)的質(zhì)控方法。因此，在滿足靈敏度要求的前提下，采取一定措施（如優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件等）提高PCR反應(yīng)的特異性，即可克服上述缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)最佳的檢測效果。

SYBR GreenⅠ熒光染料實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測畢赤酵母5S rRNA基因，當(dāng)DNA含量為1×10-1～1000 pg/μL時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，即使DNA含量低至1×10-4pg/μL也可以得到擴(kuò)增，因此該方法具有較高的靈敏度，可用于微量DNA殘留的檢測。應(yīng)用建立的檢測方法對5批注射用重組新蛭素（酵母）產(chǎn)品中殘留的宿主基因組DNA進(jìn)行測定，5批產(chǎn)品的外源DNA殘留量均符合小于100 pg/劑量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由于DNA殘留量均在檢出限附近，因此RSD值相對較大。通過增加實(shí)驗(yàn)復(fù)孔數(shù)量和重復(fù)次數(shù)，能夠得到比較穩(wěn)定而準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。該方法是一種靈敏度高、較準(zhǔn)確、簡便快速的方法，有較好的應(yīng)用和推廣前景。

[1]Staley C A,Huang A,Nattestad M,et al.Analysis of the 5'untranslated region(5'UTR)ofthe alcoholoxidase 1(AOX1)genein recombinantprotein expression in Pichia pastoris[J].Gene,2012,496(2):118-127.

[2]Chang S C,Hoang B,Thomas J T,et al.Cartilage-derived morphogenetic proteins new members of the transforming growth factor-β superfamily predominantly expressed in long bonesduringhuman embryonicdevelopment[J].BiolChem,1994,269(45):282-287.

[3]汪家政,范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京:科學(xué)技術(shù)出版社,2002:42-47.

[4]Wolter T R A.A ssays for controlling host-cell in purities in biopharmaceuticals[J].BioProcess Int,2005,3(2):40.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:三部,252.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:三部,265,279.

[7]Kuroda S,Itoh Y,Miyazaki T,et al.A supersensitive dot-hy?bridization method rapid and quantitative detection of host-de?rived DNA in recombinant products at the one picogram level[J].Biochem Biophys Res Commun,1988,152(1):9.

[8]王軍志.生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制[M].北京:科學(xué)出版社,2007:98.

[9]Lokteff M,Klinguer-Hamour C,Julien E,et al.Residual DNA quantification in clinical batches of BBG2Na,a recombi?nant subunit vaccine against human respiratory syncytial virus[J].Biologicals,2001,29(2):123.

[10]Briggs J,Panfili R.Quantitation of DNA and protein impuri?ties in biopharmaceuticals[J].Anal Chem,1991,63(9):850.

[11]Higuchi R,Fockler C,Dollinger G,et al.Kinetic PCR analy?sis:real-time monitoring of DNA amplification reactions[J].Nat Biotechnol,1993,11:1026-1030.

[12]Huong L V,Serge T,Huan H N,et al.A method for quanti?fication of absolute amounts of nucleic acids by(RT)-PCR and a new mathematical model for data analysis[J].Nucleic Acids Res,2000,28(7):18.

[13]Schmittgen T D.Real-time quantitative PCR[J].Methods,2001,25:383-385.

[14]張立國,張琚.實(shí)時定量PCR技術(shù)的介紹[J].生物技術(shù),2003,13(2):39-40.

[15]De Schutter K,Lin Yao-Cheng,Tiels P.Genome sequence of the recombinantprotein production hostPichia pastoris[J].Nat Biotechnol,2009,27(6):561-569.

[16]Nissom P M.Specific detection of residual CHO host cell DNA by real-time PCR[J].Biologicals,2007,35(3):211.