宋何煜，張耀，江紅

北京交通大學 理學院生命科學與生物工程研究院，北京 100044

生物節(jié)律是生物體普遍存在的生命現(xiàn)象，參與多種生命活動的調控。目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有10種節(jié)律基因，分別是Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1、Timeless、NPAS2和CK1ε。生物節(jié)律是由幾種核心節(jié)律基因通過轉錄-翻譯反饋環(huán)控制和維持的，反饋環(huán)由正激活因子（Clock和Bmal1）、負效應因子（Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2和Timeless）和調節(jié)因子（CK1ε）組成[1]。Timeless是生物節(jié)律和細胞周期的直接連接者，同時參與ATR-Chk1和ATMChk2兩大DNA損傷修復通路[2]，在肺和腎的胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[3]。并且，在多種癌組織中檢測到Timeless表達水平與癌旁非癌組織相比明顯不同[4-10]，提示它可能和癌癥的發(fā)生和預后密切相關。我們簡要總結了Timeless在生物節(jié)律、細胞周期、胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生發(fā)展和診療中的生物學功能研究進展。

1 Timeless基因的結構

Timeless是Michael等在篩選影響果蠅生物節(jié)律的突變體時發(fā)現(xiàn)的，位于果蠅第2多線染色體的左臂，dpp和dp基因之間[11]。不同物種中都有Timeless同源基因的存在（表1）。人類的Timeless基因位于第12號染色體，全基因長約43 kb，編碼由1208個氨基酸殘基組成的蛋白TIMELESS，該蛋白在細胞質中形成后，與PER家族成員形成二聚體入核[12]。

表1 不同生物Timeless基因的信息

2 Timeless在生物節(jié)律中的功能

生物節(jié)律是生物的一種生理和行為的周期性振蕩[19]，大部分生物的節(jié)律周期為24 h；在不同物種的生物節(jié)律活動中，Timeless的作用各不相同。

在果蠅中，當CLOCK-CYCLE二聚體激活Per和Timeless的表達時，新的節(jié)律周期開始。在黑暗條件下，PER-TIMELESS二聚體入核后，抑制CLOCKCYCLE的活性，降低其表達水平，從而終止節(jié)律周期[20]。光照可以激活光受體CRY，它和Timeless結合后引起TIMELESS的泛素化降解，節(jié)律周期發(fā)生轉換[21]。蛋白激酶CK2可以對TIMELESS進行磷酸化修飾，增加細胞質中Timeless的表達水平，從而縮短節(jié)律周期[21]。在小鼠視交叉上核，下調Timeless表達水平會使Per1、Per2和Per3表達水平降低，而Cry1和Cry2表達水平升高[22]，Per1和Per2表達水平降低可使節(jié)律周期的振幅降低[23]，Cry是Per的負調控因子，缺失Cry1和Cry2的小鼠會出現(xiàn)節(jié)律紊亂[24]。細胞周期激酶CHEK1可以和Timeless及CK2發(fā)生相互作用，CHEK1表達水平降低可使小鼠的節(jié)律周期至少縮短1 h[25]，而下調DNA解旋酶結合蛋白CDH4的表達水平可以延長節(jié)律周期。

3 Timeless在細胞周期中的功能

細胞周期的順利進行依賴于細胞周期檢測點機制的存在，其中的DNA損傷檢測點能夠延遲和阻止細胞分裂，主要有ATM（ataxia telangiectasia mutat?ed）依賴的 Chk2和 ATR（ataxia telangiectasia and Rad3-related）依賴的Chk1等2條DNA損傷信號通路[2]。出芽酵母Tof1基因和裂殖酵母Swi1基因可以激活DNA損傷檢測點，同時，Swi1可以阻止復制叉解體[19]。Tim-1是線蟲染色體凝聚的必需因子，在DNA復制中扮演著重要的角色，它的缺失會引起線蟲胚胎死亡?；趯€蟲、果蠅和小鼠的TIMELESS同源物的比較，Barbara等[26]認為TIMELESS樣蛋白保守的功能不僅僅是生物節(jié)律調節(jié)，同時調控染色體的凝聚。在小鼠和人類細胞中，Timeless和復制叉共同移動，它是復制子復合體的成員之一，它和Tip?in的相互作用可以穩(wěn)定復制叉和促進姊妹染色單體凝聚[27]。Timeless或一些蛋白（如Hus1、claspin、Chk1和Tipin）的失活可以逆轉紫外線（UV）對DNA合成的抑制作用[28]。當DNA損傷發(fā)生時，Tim-Tipin復合體啟動UV介導的S期細胞周期檢測點，下調Time?less會抑制S期細胞周期檢測點的激活，這些正好說明在小鼠Timeless缺失會引起胚胎致死現(xiàn)象[29]。雖然端粒長度的維護依賴于端粒酶，但Timeless和Shelterin家族成員TRF1和TRF2相互作用，在端粒的DNA重復區(qū)域阻止復制叉降解，促進DNA復制，進而維護端粒長度，保證染色體完整性的維持[30]。

當DNA復制被UV或羥基脲（HU）干擾后，抑制ATR-Chk1通路中蛋白的表達，促進早熟染色質凝聚（prematurechromosomecondensation，PCC）[19]。小鼠[31]和人類[2]的Timeless和Chk1相互作用，介導復制檢測點信號從ATR向Chk1傳遞，而Timeless的缺失也會引起PCC，提示Timeless參與了ATR-Chk1依賴的復制檢測點調控。阿霉素（doxorubicin，Dox）是一種治療癌癥的常用藥物，能夠激活ATM-Chk2反應通路，使細胞周期阻滯在G2/M期。人類Time?less不能激活ATM，但能激活ATM依賴的Chk2，下調Timeless使腫瘤細胞對Dox的細胞毒性更敏感[2]，提示降低Timeless表達水平的藥物可以作為提高Dox抗瘤效果的增敏劑。

4 Timeless在小鼠組織胚胎的發(fā)育中的作用

Timeless對小鼠胚胎發(fā)育至關重要，它在器官發(fā)生的初期廣泛表達于大腦、肺、心臟、肝、胃和尿生殖嵴等[3]，如果缺失可導致胚胎死亡率升高[32]。在胚胎的肺、肝、腎及神經上皮的發(fā)育過程中，Timeless表達水平較高，對上皮形成具有重要作用[33]。在9.5 d的胚胎，肺開始形成，Timeless存在于上皮細胞和間充質細胞中；在15 d胚胎的呼吸道上皮中Timeless仍維持較高的表達水平，但在間充質中的表達水平降低。Northern印跡結果也提示與18 d的小鼠胚胎和成體小鼠相比，Timeless在15 d的小鼠胚胎中表達水平最高。在肺發(fā)育過程中，Timeless表達水平的動態(tài)變化對肺的發(fā)育是至關重要的[3]。

在分支形成的器官中，Timeless基因的功能高度保守[3]。在腎發(fā)育過程中，輸尿管芽分支形成時，Timeless是一種分化表達序列，在胚胎中的表達方式與其在成體中的表達不同。Timeless表達水平降低會抑制腎的胚胎發(fā)育，提示在腎發(fā)生和其他上皮器官形成中有重要作用[33]。

5 Timeless在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和診療中作用的研究進展

5.1 腫瘤的發(fā)生和發(fā)展

惡性腫瘤的形成是一個涉及多因素多步驟的復雜過程。多項研究表明，大鼠和人類腫瘤可能是一種節(jié)律失調相關疾病。已經在多種腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌和血液系統(tǒng)腫瘤等）中發(fā)現(xiàn)生物節(jié)律分子的遺傳或功能性異常，這種異常的表現(xiàn)可能與癌癥或其他疾病的發(fā)生有重要的相關性。與對應的癌旁非癌組織相比，Timeless在不同癌組織中的表達水平明顯不同。Timeless在肺癌中mRNA和蛋白表達水平[7]以及結直腸癌中的mRNA表達水平[9]均升高，而腎癌和胰腺癌中mRNA表達水平降低，肝癌中的mRNA和蛋白水平表達也同樣下降[4,6,10]（表2）。不同文獻對乳腺癌中Timeless表達水平的報道不一致，Yong等的研究提示乳腺癌組織中Timeless的mRNA表達水平升高[8]，而Jan-Gowth等則認為乳腺癌組織中Timeless蛋白表達水平降低[5]，結果不一致的原因可能與樣品來源和檢測方法不同有關，同時基因的表達受不同水平的諸多因素調控。

Timeless在癌組織和癌旁非癌組織中的差異表達和腫瘤的預后具有相關性。肝癌中Timeless表達水平的降低和腫瘤的分級相關[4]。肺癌中Timeless高表達的患者整體生存時間明顯縮短，但與腫瘤分期和組織學分型無關，Yoshida認為Timeless可以作為肺癌診斷和預后的標記物，對肺癌的治療效果有提示價值[7]。在結直腸癌中Timeless的mRNA表達水平和TNM分期關聯(lián)密切，在TNM的Ⅲ～Ⅳ階段，Time?less的mRNA表達水平達到最高，這種升高可能和結直腸癌的發(fā)生有關，也可能與對輔助化療反應的減弱有關[9]。Yong等在80例乳腺癌組織和80例癌旁非癌組織中發(fā)現(xiàn)Timless啟動子發(fā)生甲基化，并且甲基化程度在乳腺癌的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期顯著降低，這和Timeless在乳腺癌組織中高表達是一致的[8]；而Jan-Gowth等在乳腺癌組織中未發(fā)現(xiàn)Timeless的啟動子甲基化現(xiàn)象[5]，同樣，在子宮內膜癌[34]、肝癌[4]中也得到相似的結果。在肺癌細胞NCI-H157和NCIH460中，如果下調Timeless的表達水平，可以抑制細胞增殖和克隆形成，同時誘導細胞凋亡[7]，提示它可以作為肺癌診斷和預防的標志物，同時也是具有較高治療價值的靶分子。

5.2 腫瘤的診療

鑒于Timeless連接了生物節(jié)律和細胞周期兩大調控系統(tǒng)，一些關于Timeless與癌癥易感性的遺傳學和表觀遺傳學研究成為當下熱門課題。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在人類基因組中廣泛存在，且分布具有高密度性和高保守性。研究發(fā)現(xiàn)，一些基因的SNP與腫瘤發(fā)生、預后和藥物敏感性相關，是一種便于利用的生物標志物。在441例乳腺癌組織和479例癌旁非癌組織中，Timeless的2個SNP位點（rs2291738和rs7302060）與乳腺癌的發(fā)生密切相關[8]。而Kristan[35]和Yong等[1]分別發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織和前列腺癌組織中所檢測的Timeless SNP位點與腫瘤的易感性和惡性程度無關。

表2 Timeless在各種癌組織中的差異表達及其預后相關性

節(jié)律調節(jié)是人類抵制癌癥的重要先決條件。在小鼠和大鼠的實驗模型中，用藥時間的變化會給30多種抗癌藥物的毒性和功效帶來約百分之五十的差異[36]。雌激素受體α（ERα）的表達水平可用來篩選對激素類藥物（如它莫西芬，tamoxifen）反應的乳腺癌患者，在體外實驗中，Timeless的表達水平受17β雌二醇調控，并且可以在耐它莫西芬細胞株中過表達。Timeless有望成為篩選對它莫西芬耐藥的ERα陽性乳腺癌患者的標記物[37]。通過檢測腫瘤中Timeless基因的突變，可以預測藥物敏感性的變化[9]；同時，減低Timeless的表達水平可以增強一些化療藥物的活性，這些藥物能夠激活腫瘤細胞的DNA損傷通路，提示Timeless可能是一種新的治療癌癥的藥物靶分子[2]。

6 結語

Timeless是重要的生物節(jié)律基因，在生物節(jié)律、細胞周期、胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生發(fā)展和診療中發(fā)揮重要的生物學作用，如何將這些生物學功能用于臨床尚有許多問題需要解決。Timeless在癌組織和癌旁非癌組織中的差異表達特點是否與癌癥的組織類型和發(fā)病地區(qū)有關？是否在體外和體內降低Timeless的表達水平都能夠抑制腫瘤細胞增殖、并誘導其凋亡？Timeless的SNP位點對于腫瘤易感性和治療效果的預測是否具有實用性？隨著研究數(shù)據(jù)的不斷累積和豐富，期望能夠闡明Timeless表達水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展和預后的聯(lián)系，明確其中的作用機制，充分發(fā)揮Timeless作為腫瘤診斷和治療的靶分子的作用。

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