張廣芬,張明強,孫合亮,李強,于穎群,周志強
1.南京軍區(qū) 南京總醫(yī)院麻醉科,江蘇 南京 210002;2.解放軍第307醫(yī)院 麻醉科,北京 100071
近年來大量臨床研究和動物實驗均表明,全麻藥氯胺酮具有快速有效抗抑郁作用,但其具體作用機制尚不明確[1-3]。研究表明,N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體阻斷后,微清蛋白(parvalbumin,PV)中間神經(jīng)元抑制功能下調,導致谷氨酸(Glu)信號系統(tǒng)去抑制[4-6]。鑒于Glu信號系統(tǒng)增強是氯胺酮抗抑郁的關鍵步驟[2,7],我們推測氯胺酮可能通過阻斷PV中間神經(jīng)元上的NMDA受體,介導Glu信號系統(tǒng)去抑制,進而產生抗抑郁作用。在本實驗中,我們觀察了PV中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁中的作用。
雄性Wistar大鼠,體重200~250 g,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供,實驗動物合格證書編號為0016766。在室溫25℃、相對濕度為45%的動物房適應性飼養(yǎng)1周,自由飲水,標準飲食。
采用隨機數(shù)字表法將大鼠均分為4組(n=8):生理鹽水組(S組)、氯胺酮(福建古田制藥廠,批號:20110301)組(K組)、夾竹桃麻素(Sigma公司)預處理+生理鹽水組(AS組)、夾竹桃麻素預處理+氯胺酮組(AK組)。大鼠行強迫游泳15 min制備急性應激抑郁模型。夾竹桃麻素預處理組將藥物溶于大鼠飲水中,每天5 mg/kg,共喂養(yǎng)1周,于第8 d制備模型。模型制備后24 h大鼠腹腔注射1 mL生理鹽水或氯胺酮(10 mg/kg)。
生理鹽水或氯胺酮給藥后0.5 h應用OFT進行大鼠自主活動評分,由2名經(jīng)過培訓的實驗人員根據(jù)評分標準進行盲法測評,取平均分。實驗在一個底面積75 cm×75 cm并均分為25個方格,高40 cm,沒有頂蓋的敞箱內進行。每只大鼠被放在敞箱的中央格,手動記錄大鼠在5 min內的各項得分:水平得分,為大鼠水平穿越的方格數(shù),大鼠3或4只腳爪都進入一格記為1分;垂直得分,2只前爪每離開底面一次記為1分。實驗環(huán)境安靜,清潔敞箱后進行下一只大鼠的測試。
采用大鼠FST建立急性應激抑郁模型,即將大鼠置于高65 cm、直徑30 cm、盛有23~25℃自來水的玻璃缸中,水深40 cm,游泳15 min。OFT測試后即刻將大鼠置入玻璃缸中行FST 6 min,觀察并記錄后5 min大鼠的不動時間。行為學測試由2名經(jīng)過培訓的實驗人員根據(jù)評分標準進行盲法測評,取平均值。清潔玻璃缸后進行下1只大鼠的測試。
大鼠用戊巴比妥鈉60 mg/kg于腹腔注射麻醉后經(jīng)左心室快速灌注4℃的生理鹽水200 mL,剝離前額皮層組織勻漿離心,取上清分裝并保存在-80℃冰箱中待用。用Bradford法測定蛋白濃度,電泳分離,轉膜。用封阻液室溫封阻2 h,將NC膜放入自封袋中,加PV(兔抗大鼠,1∶200)、GAD67(小鼠抗大鼠,1∶100),密封,垂直平面上緩慢旋轉搖動,4℃孵育過夜,TBST漂洗,用HRP標記的二抗(羊抗兔/小鼠,1∶2000)室溫孵育3 h,TBST漂洗,再用TBS洗5 min,用ECL試劑反應,曝光顯影,圖像掃描后采用Image J分析軟件,以目的蛋白與內參β-actin灰度值的比值反映蛋白表達水平。
計量數(shù)據(jù)以x±SEM表示,采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
4組大鼠水平運動及垂直運動均無顯著差異(P>0.05),結果見圖1。
與S組相比,K組大鼠FST不動時間明顯減少(P<0.05),AS組無顯著差異(P>0.05);與K組相比,AK組大鼠FST不動時間明顯增加(P<0.05)(圖2)。
與S組相比,K組大鼠PV及GAD67的表達明顯減少(P<0.05),AS組無顯著差異(P>0.05);與K組相比,AK組大鼠PV及GAD67的表達明顯增加(P<0.05)(圖3)。
PV中間神經(jīng)元為γ-氨基丁酸(GABA)能中間神經(jīng)元,在調節(jié)錐體細胞的活動中起著重要作用。研究表明,PV中間神經(jīng)元的功能下調在氯胺酮致精神分裂樣表現(xiàn)中發(fā)揮重要作用[4-5]。然而,在氯胺酮抗抑郁中PV中間神經(jīng)元是否亦發(fā)揮作用尚不清楚。本研究觀察到氯胺酮10 mg/kg具有明確的抗抑郁效果,能顯著減少強迫游泳大鼠不動時間,夾竹桃麻素預處理能阻斷氯胺酮的這種抗抑郁作用;氯胺酮給藥后0.5 h大鼠大腦前額皮層PV中間神經(jīng)元中PV及GAD67的表達顯著下降,夾竹桃麻素預處理后能阻斷氯胺酮所致PV及GAD67表達的下降。
圖1 氯胺酮對大鼠敞箱實驗水平運動及垂直運動的影響
圖2 氯胺酮對大鼠強迫游泳實驗不動時間的影響
圖3 氯胺酮對大鼠前額皮層PV及GAD67表達的影響
前額皮層在抑郁癥等情感障礙中發(fā)揮重要作用,是研究氯胺酮抗抑郁機制常涉及到的腦區(qū),故本研究選取大鼠前額皮層作為檢測區(qū)域[2-3]。Li等[2-3]研究表明,氯胺酮快速有效的抗抑郁作用依賴于磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的快速上調,進一步導致下游信號通路的激活,從而促使突觸蛋白及突觸數(shù)量的增加,然而氯胺酮導致mTOR信號通路增強的潛在機制仍不清楚。以往研究證實,Glu能-α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)受體活化在氯胺酮導致的mTOR信號通路增強中發(fā)揮重要作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn),氯胺酮能夠導致大鼠前額皮層PV中間神經(jīng)元抑制功能下降,這可能促使Glu信號系統(tǒng)去抑制,從而發(fā)揮抗抑郁作用。
還原型輔酶Ⅱ(NADPH)抑制劑夾竹桃麻素能減少超氧化物的產生,阻斷氯胺酮所致PV及GAD67的表達下降[4]。因此,我們選用夾竹桃麻素預處理,結果表明這種預處理能夠阻斷氯胺酮的抗抑郁作用及其所致PV及GAD67蛋白表達的下降,進一步表明PV中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁中發(fā)揮重要作用。
綜上所述,本研究結果提示,PV中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁過程中發(fā)揮重要作用,但其確切機制仍須進一步研究。
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