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        微清蛋白中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁中的作用

        2014-10-27 09:04:44張廣芬張明強(qiáng)孫合亮李強(qiáng)于穎群周志強(qiáng)
        生物技術(shù)通訊 2014年3期
        關(guān)鍵詞:夾竹桃前額氯胺酮

        張廣芬,張明強(qiáng),孫合亮,李強(qiáng),于穎群,周志強(qiáng)

        1.南京軍區(qū) 南京總醫(yī)院麻醉科,江蘇 南京 210002;2.解放軍第307醫(yī)院 麻醉科,北京 100071

        近年來(lái)大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明,全麻藥氯胺酮具有快速有效抗抑郁作用,但其具體作用機(jī)制尚不明確[1-3]。研究表明,N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體阻斷后,微清蛋白(parvalbumin,PV)中間神經(jīng)元抑制功能下調(diào),導(dǎo)致谷氨酸(Glu)信號(hào)系統(tǒng)去抑制[4-6]。鑒于Glu信號(hào)系統(tǒng)增強(qiáng)是氯胺酮抗抑郁的關(guān)鍵步驟[2,7],我們推測(cè)氯胺酮可能通過(guò)阻斷PV中間神經(jīng)元上的NMDA受體,介導(dǎo)Glu信號(hào)系統(tǒng)去抑制,進(jìn)而產(chǎn)生抗抑郁作用。在本實(shí)驗(yàn)中,我們觀察了PV中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁中的作用。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        雄性Wistar大鼠,體重200~250 g,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證書(shū)編號(hào)為0016766。在室溫25℃、相對(duì)濕度為45%的動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,自由飲水,標(biāo)準(zhǔn)飲食。

        1.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

        采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠均分為4組(n=8):生理鹽水組(S組)、氯胺酮(福建古田制藥廠,批號(hào):20110301)組(K組)、夾竹桃麻素(Sigma公司)預(yù)處理+生理鹽水組(AS組)、夾竹桃麻素預(yù)處理+氯胺酮組(AK組)。大鼠行強(qiáng)迫游泳15 min制備急性應(yīng)激抑郁模型。夾竹桃麻素預(yù)處理組將藥物溶于大鼠飲水中,每天5 mg/kg,共喂養(yǎng)1周,于第8 d制備模型。模型制備后24 h大鼠腹腔注射1 mL生理鹽水或氯胺酮(10 mg/kg)。

        1.3 敞箱實(shí)驗(yàn)(open field test,OFT)

        生理鹽水或氯胺酮給藥后0.5 h應(yīng)用OFT進(jìn)行大鼠自主活動(dòng)評(píng)分,由2名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法測(cè)評(píng),取平均分。實(shí)驗(yàn)在一個(gè)底面積75 cm×75 cm并均分為25個(gè)方格,高40 cm,沒(méi)有頂蓋的敞箱內(nèi)進(jìn)行。每只大鼠被放在敞箱的中央格,手動(dòng)記錄大鼠在5 min內(nèi)的各項(xiàng)得分:水平得分,為大鼠水平穿越的方格數(shù),大鼠3或4只腳爪都進(jìn)入一格記為1分;垂直得分,2只前爪每離開(kāi)底面一次記為1分。實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜,清潔敞箱后進(jìn)行下一只大鼠的測(cè)試。

        1.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test,F(xiàn)ST)

        采用大鼠FST建立急性應(yīng)激抑郁模型,即將大鼠置于高65 cm、直徑30 cm、盛有23~25℃自來(lái)水的玻璃缸中,水深40 cm,游泳15 min。OFT測(cè)試后即刻將大鼠置入玻璃缸中行FST 6 min,觀察并記錄后5 min大鼠的不動(dòng)時(shí)間。行為學(xué)測(cè)試由2名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法測(cè)評(píng),取平均值。清潔玻璃缸后進(jìn)行下1只大鼠的測(cè)試。

        1.5 Western印跡檢測(cè)PV及谷氨酸脫羧酶67(GAD67)的表達(dá)

        大鼠用戊巴比妥鈉60 mg/kg于腹腔注射麻醉后經(jīng)左心室快速灌注4℃的生理鹽水200 mL,剝離前額皮層組織勻漿離心,取上清分裝并保存在-80℃冰箱中待用。用Bradford法測(cè)定蛋白濃度,電泳分離,轉(zhuǎn)膜。用封阻液室溫封阻2 h,將NC膜放入自封袋中,加PV(兔抗大鼠,1∶200)、GAD67(小鼠抗大鼠,1∶100),密封,垂直平面上緩慢旋轉(zhuǎn)搖動(dòng),4℃孵育過(guò)夜,TBST漂洗,用HRP標(biāo)記的二抗(羊抗兔/小鼠,1∶2000)室溫孵育3 h,TBST漂洗,再用TBS洗5 min,用ECL試劑反應(yīng),曝光顯影,圖像掃描后采用Image J分析軟件,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值反映蛋白表達(dá)水平。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        計(jì)量數(shù)據(jù)以x±SEM表示,采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 氯胺酮對(duì)大鼠OFT水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)的影響

        4組大鼠水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)均無(wú)顯著差異(P>0.05),結(jié)果見(jiàn)圖1。

        2.2 氯胺酮對(duì)大鼠FST不動(dòng)時(shí)間的影響

        與S組相比,K組大鼠FST不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.05),AS組無(wú)顯著差異(P>0.05);與K組相比,AK組大鼠FST不動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.05)(圖2)。

        2.3 氯胺酮對(duì)大鼠前額皮層PV及GAD67表達(dá)的影響

        與S組相比,K組大鼠PV及GAD67的表達(dá)明顯減少(P<0.05),AS組無(wú)顯著差異(P>0.05);與K組相比,AK組大鼠PV及GAD67的表達(dá)明顯增加(P<0.05)(圖3)。

        3 討論

        PV中間神經(jīng)元為γ-氨基丁酸(GABA)能中間神經(jīng)元,在調(diào)節(jié)錐體細(xì)胞的活動(dòng)中起著重要作用。研究表明,PV中間神經(jīng)元的功能下調(diào)在氯胺酮致精神分裂樣表現(xiàn)中發(fā)揮重要作用[4-5]。然而,在氯胺酮抗抑郁中PV中間神經(jīng)元是否亦發(fā)揮作用尚不清楚。本研究觀察到氯胺酮10 mg/kg具有明確的抗抑郁效果,能顯著減少?gòu)?qiáng)迫游泳大鼠不動(dòng)時(shí)間,夾竹桃麻素預(yù)處理能阻斷氯胺酮的這種抗抑郁作用;氯胺酮給藥后0.5 h大鼠大腦前額皮層PV中間神經(jīng)元中PV及GAD67的表達(dá)顯著下降,夾竹桃麻素預(yù)處理后能阻斷氯胺酮所致PV及GAD67表達(dá)的下降。

        圖1 氯胺酮對(duì)大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)的影響

        圖2 氯胺酮對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響

        圖3 氯胺酮對(duì)大鼠前額皮層PV及GAD67表達(dá)的影響

        前額皮層在抑郁癥等情感障礙中發(fā)揮重要作用,是研究氯胺酮抗抑郁機(jī)制常涉及到的腦區(qū),故本研究選取大鼠前額皮層作為檢測(cè)區(qū)域[2-3]。Li等[2-3]研究表明,氯胺酮快速有效的抗抑郁作用依賴于磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的快速上調(diào),進(jìn)一步導(dǎo)致下游信號(hào)通路的激活,從而促使突觸蛋白及突觸數(shù)量的增加,然而氯胺酮導(dǎo)致mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)的潛在機(jī)制仍不清楚。以往研究證實(shí),Glu能-α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)受體活化在氯胺酮導(dǎo)致的mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)中發(fā)揮重要作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn),氯胺酮能夠?qū)е麓笫笄邦~皮層PV中間神經(jīng)元抑制功能下降,這可能促使Glu信號(hào)系統(tǒng)去抑制,從而發(fā)揮抗抑郁作用。

        還原型輔酶Ⅱ(NADPH)抑制劑夾竹桃麻素能減少超氧化物的產(chǎn)生,阻斷氯胺酮所致PV及GAD67的表達(dá)下降[4]。因此,我們選用夾竹桃麻素預(yù)處理,結(jié)果表明這種預(yù)處理能夠阻斷氯胺酮的抗抑郁作用及其所致PV及GAD67蛋白表達(dá)的下降,進(jìn)一步表明PV中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁中發(fā)揮重要作用。

        綜上所述,本研究結(jié)果提示,PV中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但其確切機(jī)制仍須進(jìn)一步研究。

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