王亞楠，金蕊，張憲，馬世良，黃君健

1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，它在人類疾病治療方面得到迅速發(fā)展，為某些疾病的治療提供了新的策略。RNA干擾可以使特定的基因沉默，利用RNA干擾治療疾病的優(yōu)勢(shì)在于它可以特異而高效地敲除引起疾病的基因的表達(dá)。RNA干擾常用的是小干擾RNA（siRNA）和短發(fā)夾RNA（shRNA）。siRNA可以暫時(shí)降低基因的表達(dá)，但隨著細(xì)胞的分裂，siRNA的濃度就會(huì)降低,需要經(jīng)常性的轉(zhuǎn)染，很難適應(yīng)細(xì)胞試驗(yàn)中需要長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞的需要；而shRNA可以插入RNA干擾載體中，只要shRNA能夠轉(zhuǎn)錄即可對(duì)目標(biāo)基因造成長(zhǎng)期、穩(wěn)定的敲除作用[1-2]。因此，shRNA干擾越來(lái)越受到重視。慢病毒載體可以將外源基因整合到宿主染色體上，同時(shí)其極高的轉(zhuǎn)染效率在臨床研究上效果非常明顯，已得到廣泛應(yīng)用。在本研究中，我們針對(duì)人核磷蛋白（nucleophosmin，NPM）NPM1基因，用pll3.7質(zhì)粒載體構(gòu)建了有效的shRNA干擾慢病毒載體，為研究NPM1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及腫瘤的治療提供一個(gè)有力的工具。

NPM1是NPM家族（包括NPM1、NPM2、NPM3等3種亞基）中重要的一員，又名B23、numatrin或NO38。人NPM1基因定位于染色體5q35，全長(zhǎng)約23 kb，含12個(gè)外顯子。NPM1是一種核仁磷酸化蛋白質(zhì)，主要分布在核仁區(qū)域[3]，參與核糖體的生物合成，控制中心體復(fù)制，具有分子伴侶作用[4-5]。NPM1基因作為調(diào)控中心體復(fù)制起始的關(guān)鍵基因，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等不同腫瘤中，NPM1都呈過(guò)表達(dá)水平[8]，其還與細(xì)胞分裂次數(shù)和增殖值率密切相關(guān)。這些都表明，NPM的過(guò)表達(dá)引發(fā)腫瘤的發(fā)生[9]，特別是與造血干細(xì)胞疾病如白血病和淋巴瘤密切相關(guān)[10]。因此，有效地抑制腫瘤細(xì)胞中NPM1的表達(dá)，有希望成為靶向治療腫瘤的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

293T細(xì)胞，HT1080細(xì)胞，大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒pll3.7（圖1），包裝載體RRE、REV、VSVG均由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Exygen公司；膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生物公司；限制性內(nèi)切酶HpaⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ，T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；RT-PCR相關(guān)試劑、LipofectAMINE 2000購(gòu)自Invit?rogen公司；NPM1抗體購(gòu)自Epitomics公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗購(gòu)自Sigma公司；Western印跡顯色試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；核酸電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自Bio-Rad公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 靶向NPM1的shRNA設(shè)計(jì)

根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，參考GenBank公布的人NPM1（NM_002520），用Invitrogen公司在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)shRNA序列（shRNA對(duì)照、shRNA1、shRNA2、shRNA3），進(jìn)行Blast同源性分析，保證序列的惟一性。為方便克隆，在其5′和3′端分別引入HpaⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)（為方便鑒定，設(shè)計(jì)時(shí)將酶切位點(diǎn)消掉），反義片段后接終止信號(hào)TTTTTT以終止轉(zhuǎn)錄。序列由英駿公司合成，見(jiàn)表1。

1.3 NPM1干擾載體的構(gòu)建

將合成的寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA（95℃5 min，72℃ 10 min，自然降至室溫），同時(shí)將shRNA載體pll3.7用HpaⅠ/XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后，把退火形成的DNA雙鏈與酶切回收的線性化載體片段于16℃連接過(guò)夜，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，之后將其涂布在氨芐西林抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，每個(gè)平板挑4個(gè)菌落，擴(kuò)增，提質(zhì)粒，用EcoRⅠ/HpaⅠ酶切鑒定，將已插入shRNA片段的載體送北京博邁德公司測(cè)序。

1.4 293T細(xì)胞的培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將293T細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2～3 d將細(xì)胞傳代培養(yǎng)；將細(xì)胞鋪6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染程序按照LipofectAMINE 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，培養(yǎng)48～72 h后收集細(xì)胞。

1.5 Western印跡檢測(cè)shRNA的抑制效果

圖1 pll3.7 RNA干擾載體質(zhì)粒圖譜

表1 針對(duì)人NPM1基因設(shè)計(jì)的4對(duì)shRNA序列

收集細(xì)胞，用RAPI裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，用抗NPM1的一抗孵育2 h，用TBST清洗3次，每次5 min，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗孵育1 h，用TBST清洗3次，每次5 min，按照Western印跡顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)顯色1～2 min，暗室壓片顯影。

1.6 慢病毒的包裝與感染

10 cm皿的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)，將慢病毒包裝載體RRE、REV、VSVG與干擾質(zhì)粒依次按4.2、2.1、3.1、4 μg混合，加入氯化鈉注射用水750 μL，混勻；40 μL轉(zhuǎn)染試劑同樣加入氯化鈉注射用水750 μL，混勻；將前兩者混勻，靜置15 min，加入細(xì)胞中，72 h后收上清，用孔徑0.45 μm的濾膜過(guò)濾，所獲即為包裝好的病毒，將其感染HT1080細(xì)胞，其余的病毒用小管分裝，-80℃凍存，反復(fù)感染細(xì)胞，直到感染效率達(dá)90%以上。

1.7 在HT1080細(xì)胞中驗(yàn)證shRNA的干擾效果

收集感染病毒后的HT1080細(xì)胞，取1/3，提取細(xì)胞總RNA，按照Invitrogen公司的TRIzol試劑提取總RNA 說(shuō)明書(shū)提取 RNA,并將其稀釋到 500 μg/μL。按照Invitrogen公司M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明書(shū)合成cDNA，取上述產(chǎn)物2 μL，按一般方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參基因。β-actin上游引物為5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游引物為5'-G CTGTCACCTTCACCGTTCC-3'；NPM1 上游引物 為5'-CGGGATCCGAAGATTCGATGGACATGGAC-3'，下游引物為5'-ATATGCGGCCGCTAAAGAGACTTC CTCCACTGC-3'。

利用余下的感染后的HT1080細(xì)胞，提取其總蛋白，Western印跡鑒定抑制效果。

2 結(jié)果

2.1 NPM1 shRNA序列設(shè)計(jì)

根據(jù)人NPM1序列設(shè)計(jì)了4對(duì)shRNA序列（表1），經(jīng)Blast分析人基因數(shù)據(jù)庫(kù)序列，shRNA對(duì)照、shRNA2、shRNA3未發(fā)現(xiàn)同源序列，說(shuō)明序列特異性好；shRNA1與CLEC2D蛋白的基因具有同源序列，但因NPM1基因序列與CLEC2D基因序列相似度達(dá)93%，姑且使用shRNA1序列。

2.2 NPM1 shRNA干擾載體的鑒定

經(jīng)EcoRⅠ/HpaⅠ酶切，pll3.7空載體可切下1500 bp的片段，而pll-shRNA control、pll-shRNA1、pll-shRNA2、pll-shRNA3質(zhì)粒不能切得1500 bp的片段（圖2），表明后4個(gè)載體中已插入外源片段。測(cè)序結(jié)果表明，插入的外源片段序列正確（序列略）。

2.3 pll-shRNA對(duì)NPM1蛋白表達(dá)的沉默效果

Western印跡結(jié)果經(jīng)PS5軟件分析，設(shè)計(jì)的3條shRNA對(duì)NPM都有不同程度的抑制效果，抑制效果分別為20%、78%、36%，即pll-shRNA2的抑制效果最好，抑制率達(dá)78%，提示pll-shRNA2具有較好的沉默NPM1基因的效果（圖3）。

2.4 利用HT1080細(xì)胞驗(yàn)證pll-shRNA2的抑制效果

經(jīng)過(guò)多次感染病毒，pll-shRNA2慢病毒感染效率達(dá)90%以上（圖4）。RT-PCR和Western印跡結(jié)果表明，感染pll-shRNA2病毒的HT1080細(xì)胞中幾乎沒(méi)有NPM1的mRNA和NPM蛋白的存在（圖5），在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都表明構(gòu)建的載體具有很好的抑制效果。

圖2 質(zhì)粒EcoRⅠ/HpaⅠ雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳

圖3 pll-shRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后NPM1蛋白的表達(dá)

圖4 pll-shRNA2病毒對(duì)HT1080細(xì)胞的感染效率

圖5 pll-shRNA2病毒對(duì)HT1080細(xì)胞中NPM1的抑制效果

3 討論

臨床常用的傳統(tǒng)的腫瘤治療方案放療和化療對(duì)人體有很大的毒副作用，而RNA干擾可以抑制特定腫瘤的特異分子，實(shí)現(xiàn)特定組織或器官的靶向治療，降低對(duì)正常組織器官的傷害，已在臨床上得到了應(yīng)用。如通過(guò)抑制前列腺癌細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志分子PMSA的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)前列腺癌的治療[11]；用特定的shRNA敲除患胰腺癌小鼠體內(nèi)糖原合酶3（GST-3b）基因，抑制了腫瘤生長(zhǎng)和血管形成[12]。

研究表明，NPM1促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、在腫瘤細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞系統(tǒng)腫瘤，如白血病、淋巴瘤等中過(guò)表達(dá)[10]。因此，有效抑制NPM1的表達(dá)，有希望成為治療造血干細(xì)胞系統(tǒng)腫瘤的一個(gè)新方法。

我們根據(jù)shRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)了shRNA及空對(duì)照，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，得到抑制效果最好的pllshRNA2載體，測(cè)序正確后其病毒多次感染HT1080細(xì)胞，分別在mRNA水平和蛋白水平得到了驗(yàn)證，抑制效率幾乎達(dá)100%，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的目的。該NPM1載體的構(gòu)建，為NPM1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究提供了有力工具，為抗腫瘤的治療提供了依據(jù)。

利用RNA干擾技術(shù)治療疾病在一定程度上得到了肯定，但其臨床應(yīng)用還存在很大的挑戰(zhàn)：如運(yùn)載RNA的載體作為一個(gè)外源物體，可能對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)造成一些干擾反應(yīng)[13]；RNA干擾還可能造成一些非目標(biāo)基因的抑制[14]；合適的shRNA載體的選擇和啟動(dòng)子的選擇，對(duì)干擾效果也是至關(guān)重要的。相信隨著眾多學(xué)者的努力，RNA干擾技術(shù)最終會(huì)在治療疾病方面發(fā)揮重要作用。

[1]Brummelkamp T R，Bernards R，Agami R.A system for sta?ble expression of short interfering RNA in mammalian cells[J].Science,2002,296(5567):550-553.

[2]Paddison P J,Caudy A A,Bernstein E,et al.Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mamma?lian cells[J].Genes Dev,2002,16:948-958.

[3]Kang Y J,Olson M O,Jones C,et al.Nucleolar phosphopro?teins of normal rat liver and Novikoff hepatoma ascites cells[J].Cancer Res,1975,35:1470-1475.

[4]Falini B,Mecucci C,Tiacci E,et al.Cytoplasmic nucleophos?min in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype[J].N Eng1 J Med,2005,352(3):254-266.

[5]Mitsuru O.The structure and functions of NPM1/nucleophsmin/B23,a multifunctional nucleolar acidic protein[J].J Biochem,2008,143(4):441-448.

[6]Chan W Y,Liu Q R,Borjigin J,et al.Characterization of the cDNA encoding human nucleophosmin and studies of its role in normal and abnormal growth[J].Biochemistry,1989,28(3):1033-1039.

[7]Grisendi S,Mecucci C,Falini B,et al.Nucleophosmin and cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6:493-505.

[8]Yung B Y.Oncogenic role of nucleophosmin/B23[J].Chang Gung Med J,2007,30:285-293.

[9]Colombo E,Alcalay M,Pelicci P G.Nucleophosmin and its complex network:a possible therapeutic targetin hematological diseases[J].,Oncogene,2011,30:2595-2609.

[10]Falini B,Mecucci C,Tiacci E,et al.Cytoplasmic nucleophos?min in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype[J].N Engl J Med,2005,352:254-266.

[11]McNamara J O,Andrechek E R,Wang Y,et al.Cell typespecific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras[J].Nat Biotechnol,2006,24:1005-1015.

[12]Zhou W,Wang L,Gou S,et al.shRNA silencing glycogen synthase kinase-3 beta inhibits tumor growth and angiogene?sis in pancreatic cancer[J].Cancer Lett,2012,316:178-186.

[13]Bridge A J,Pebernard S,Ducraux A,et al.Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells[J].Nat Genet,2003,34(3):263-264.

[14]Jackson A L,Bartz S R,Schelter J,et al.Expression profil?ing reveals off-target gene regulation by RNAi[J].Nat Biotech?nol,2003,21(6):635-638.