丁紅梅，趙強(qiáng)，王瑋，李慧，劉農(nóng)樂，李潔，蘇雪婷，黃皚雪，房濤，李少華，邵寧生

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.武警后勤學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，天津 300162

人vasorin（VASN）蛋白在果蠅中的同源蛋白又稱為SLIT-like 2（SLITL2），關(guān)于該蛋白的研究報(bào)道相對(duì)較少。正常情況下，VASN蛋白主要在大動(dòng)脈的血管平滑肌細(xì)胞表面強(qiáng)表達(dá)，部分脫落成為分泌型；VASN mRNA在腎臟和胎盤中少量表達(dá)，在其他正常組織如心、腦、結(jié)腸、胸腺、肝臟等中微弱表達(dá)[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，VASN能夠參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血管形成[1-2]，主要通過下調(diào)TGF-β參與損傷血管的應(yīng)答反應(yīng)，最終影響血管壁的形成。VASN蛋白能夠結(jié)合TGF-β，減弱TGF-β的信號(hào)傳導(dǎo)，吸引血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和誘導(dǎo)其形成血管樣結(jié)構(gòu)，并抑制白細(xì)胞的遷移[2]。

TGF-β與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化、抑制機(jī)體免疫功能、增加血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中均具有重要作用。而在腫瘤的發(fā)展過程中，腫瘤誘導(dǎo)的新生血管形成、腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的“通訊”一直被認(rèn)為是最重要的。因而，VASN與TGF-β通路、腫瘤的關(guān)系引起我們的關(guān)注[5]。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，VASN蛋白是一種典型的Ⅰ型膜蛋白，含有串聯(lián)的富含亮氨酸（LRR）結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）樣結(jié)構(gòu)域和纖連蛋白Ⅲ（FN3）結(jié)構(gòu)域，而其他含有這些結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和黏附分子通常都具有多個(gè)結(jié)合分子，通過多條通路發(fā)揮生物學(xué)功能[3]。此外，該蛋白名稱的來源蛋白——SLIT蛋白家族成員（包括1、2、3），同樣在細(xì)胞膜表面和細(xì)胞外分泌表達(dá)，同樣在神經(jīng)軸突形成和血管形成中具有重要作用，且盡管與VASN/SLITL2蛋白一級(jí)序列的同源性并不高，但同樣含有串聯(lián)的LRR、EGF樣結(jié)構(gòu)域，另外還有層粘連蛋白G樣模件，近年來多篇報(bào)道認(rèn)為SLIT蛋白在多種實(shí)體瘤中表達(dá)，并與腫瘤的惡性程度相關(guān)，是抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的重要靶分子，其機(jī)制可能是通過內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體Roundabout（Robo）介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)新生血管形成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡抑制白細(xì)胞遷移等[4]。因此，VASN與TGF-β通路、腫瘤的關(guān)系也是我們實(shí)驗(yàn)室的研究方向。

由于有關(guān)VASN的研究報(bào)道較少，且沒有商品化VASN標(biāo)準(zhǔn)品出售，因此，表達(dá)、純化VASN蛋白對(duì)于深入研究該蛋白的生物學(xué)功能具有重要意義。我們運(yùn)用PCR技術(shù)，從人肝癌細(xì)胞株HepG2的cDNA中擴(kuò)增獲得VASN基因，將其克隆至pET28a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用載體上的His標(biāo)簽純化了融合蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）菌株，原核表達(dá)載體pET28a均由本室保存；高效克隆PCR產(chǎn)物專用載體pMD18T購(gòu)自TaKaRa公司；Ni2+金屬螯合層析柱購(gòu)自GE公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自Promega公司；兔抗人VASN單克隆抗體購(gòu)自Abnova公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自Santa Gruz公司；TRIzol試劑為Invit?rogen公司產(chǎn)品；通用引物oligo-dT由上海生工公司合成；其他化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 cDNA的獲得

用TRIzol法提取HepG2細(xì)胞總RNA。取總RNA 1 μg、oligo-dT 0.5 μg，用DEPC水補(bǔ)足5 μL，70℃變性5 min后，加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL、25 mmol/L MgCl22.4 μL、25 mmol/L dNTP 0.4 μL、DEPC水6.7 μL、40 U/μL核糖核酸酶抑制劑0.5 μL、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL組成20 μL體系，42℃反應(yīng)1 h后70℃處理15 min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，制備的cDNA保存于-20備用。

1.3 目的基因的擴(kuò)增及鑒定

引 物 P1（3'-gggaattccatatgtgcccatccggctgccagt-5'）和 P2（5'-ccggaattcgagcggcaggttgccctcgc-3'）各100 ng、cDNA 10 ng，按常規(guī)PCR步驟加入Taq酶、dNTP、1×Taq酶緩沖液，用ddH2O補(bǔ)至100 μL體系，運(yùn)行PCR程序（95℃ 10 min，94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后延伸10 min）。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定并分析，確定獲得擴(kuò)增產(chǎn)物片段。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收、純化，獲得目的基因片段。將目的基因片段與高效克隆PCR產(chǎn)物專用載體pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-VASN。引物合成及測(cè)序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

對(duì)測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-VASN進(jìn)行質(zhì)粒的提取，詳細(xì)步驟參照小量質(zhì)粒提取試劑盒操作說明書。提取的質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段；用NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切大腸桿菌表達(dá)載體pET28a，回收載體片段；將上述酶切片段于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取克隆接種于5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃搖床上振蕩培養(yǎng)過夜；收集菌液提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，用引物P1和P2進(jìn)行PCR鑒定及NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將轉(zhuǎn)化有pET28a-VASN表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a-VASN于37℃培養(yǎng)過夜，然后按照1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌D600nm值為0.6以上時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L,37℃條件下繼續(xù)振搖6 h，離心收集菌體，制備電泳樣品，行10%的SDS-PAGE，對(duì)轉(zhuǎn)化有pET28a對(duì)照質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a做同樣處理。

1.6 目的蛋白的表達(dá)形式分析及純化

將電泳鑒定正確的陽(yáng)性菌液進(jìn)行目的蛋白表達(dá)。菌液按1∶100的比例接種振蕩培養(yǎng)過夜，次日晨繼續(xù)按1∶100轉(zhuǎn)接入400 mL LB培養(yǎng)基中，待細(xì)菌D600nm值為1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h；4℃條件下收集菌體，將菌體沉淀懸浮于1×PBS液中，置冰上超聲波破碎菌體（超聲功率400 W，超聲10 s間隔20 s，時(shí)間30 min），4℃離心，取上清與沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，以確定目的蛋白是否存在可溶性表達(dá)。采用Ni2+金屬螯合層析柱純化目的蛋白，按照GE公司操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.7 目的蛋白的Western印跡鑒定

將誘導(dǎo)后的菌體總蛋白，及誘導(dǎo)后的菌體超聲波沉淀和上清行SDS-PAGE，以兔抗人VASN兔單克隆抗體（1∶300）為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶8000）為二抗，行Western印跡鑒定。

2 結(jié)果

2.1 VASN基因的克隆及鑒定

以肝癌細(xì)胞HepaG2的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到目的片段，1%瓊脂糖電泳分析表明，擴(kuò)增的片段與預(yù)期1667 bp大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物純化后克隆至高效克隆載體pMD18-T中，隨機(jī)挑取4個(gè)克隆，以菌液為模板行PCR擴(kuò)增鑒定，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)1～3號(hào)菌液的結(jié)果與預(yù)期一致（圖2）。將1號(hào)菌液送交公司測(cè)序，序列結(jié)果分析比對(duì)證明擴(kuò)增的目的基因胞外區(qū)片段序列及讀框正確。

2.2 pET28a-VASN表達(dá)載體的構(gòu)建

選取測(cè)序結(jié)果正確的克隆，提取質(zhì)粒，NdeⅠ/EcoRⅠ酶切回收目的片段，與經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體pET28a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VASN。隨機(jī)挑取5個(gè)克隆，以菌液為模板行PCR擴(kuò)增鑒定，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)1、4、5號(hào)菌液的結(jié)果與預(yù)期一致，基因片段長(zhǎng)度約為1700 bp（圖3）。將1號(hào)菌液送交公司測(cè)序，序列結(jié)果分析比對(duì)證明擴(kuò)增的目的基因片段序列及讀框正確，表明目的基因已正確克隆入pET28a表達(dá)載體。

2.3 重組蛋白VASN的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

重組大腸桿菌 BL21（DE3）/pET28a-VASN 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行10%的SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，相對(duì)蛋白分子質(zhì)量約61×103處有一條較為明顯的特異蛋白條帶，與預(yù)期一致，且在D600nm值為0.8時(shí)誘導(dǎo)的相對(duì)表達(dá)量高（圖4）。將誘導(dǎo)表達(dá)菌體經(jīng)超聲波破碎后離心，將上清與沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要集中于包涵體中（圖5）。為了進(jìn)一步確證表達(dá)的目的蛋白及表達(dá)形式，將菌體總蛋白、超聲波上清及包涵體經(jīng)10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，Western印跡鑒定表達(dá)的蛋白及存在形式，結(jié)果表明誘導(dǎo)的蛋白被VASN單抗特異識(shí)別，且僅在包涵體中存在，上清中檢測(cè)不到目的蛋白（圖6）。

圖1 VASN cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

圖2 pMD18-T-VASN克隆的PCR鑒定

圖3 重組質(zhì)粒pET28a-VASN的PCR鑒定結(jié)果

圖4 不同菌液D600nm值條件下IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 目的蛋白表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果

2.4 重組VASN蛋白的純化

目的蛋白經(jīng)超聲波破碎后，離心收集菌體，經(jīng)0.5%Tween-20漂洗2次，用8 mol/L尿素溶解包涵體，經(jīng)0.45 μm膜過濾，過Ni2+金屬螯合柱進(jìn)行純化，采用0～100 mmol/L咪唑梯度洗脫目的蛋白，電泳結(jié)果表明目的蛋白得到了較好的純化（圖7）。

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡

圖7 目的蛋白的Ni2+柱純化結(jié)果

3 討論

VASN是Ⅰ型跨膜蛋白，一次跨膜，多肽鏈的N端在胞外，C端在胞內(nèi)。VASN由673個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量為74×103。據(jù)報(bào)道，VASN在人肺癌細(xì)胞株A549及倉(cāng)鼠卵巢癌細(xì)胞株CHO中高表達(dá)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中，ADAM17通過調(diào)節(jié)VASN的水平控制TGF-β介導(dǎo)的上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT），臨床試驗(yàn)也證實(shí)抑制ADAM17能夠抗腫瘤[7]，可以作為靶標(biāo)應(yīng)用于臨床，成為早期控制腫瘤發(fā)展的有效手段。目前的研究主要證明膜型表達(dá)的VASN在ADAM17的調(diào)控下剪切脫落為分泌型蛋白，分泌型蛋白通過與TGF-β結(jié)合并減弱TGF-β信號(hào)來發(fā)揮調(diào)節(jié)血管及神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生過程[1-3]。VASN胞外區(qū)的LRR、EGF樣和FN3結(jié)構(gòu)域通常都具有多個(gè)結(jié)合分子，因此推測(cè)可能還通過多條通路發(fā)揮其他生物學(xué)功能[8]。因此，表達(dá)、純化VASN蛋白的胞外區(qū)具有重要意義。我們通過構(gòu)建VASN胞外區(qū)重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下獲得了重組目的蛋白，并初步進(jìn)行了Ni2+柱純化，獲得了純度為90%的目的蛋白。經(jīng)過多種條件探討，包括誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、菌體吸光度值等，均發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式存在。獲得具有生物學(xué)活性的VASN蛋白，對(duì)于肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究具有一定的意義。后續(xù)工作仍需要對(duì)其進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)活性檢測(cè)，目前這一部分工作仍在進(jìn)行中。

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