申彤，徐慶陽(yáng)，張成林，謝希賢

1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046

L-色氨酸是人體必需的氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)等領(lǐng)域，但因目前生產(chǎn)成本較高，限制了其應(yīng)用規(guī)模。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求的加大，色氨酸的生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，對(duì)生產(chǎn)菌株的要求也越來(lái)越高。應(yīng)用重組DNA技術(shù)和相關(guān)的遺傳學(xué)手段進(jìn)行有精確目標(biāo)的基因操作，這一代謝工程新思路已在色氨酸生產(chǎn)菌中得到廣泛應(yīng)用，大大提高了色氨酸的發(fā)酵產(chǎn)酸水平，其育種的高度定向性也大大改善了過(guò)去誘變育種的盲目性[1]。代謝流分析（metabolic flux analysis，MFA）是對(duì)代謝途徑流量進(jìn)行測(cè)定分析的方法[2]。近年來(lái)，人們通過(guò)代謝工程方法改變細(xì)胞內(nèi)部的代謝流分布，使其生成更多的目的產(chǎn)物。代謝流分析成為代謝工程中用以指導(dǎo)遺傳操作的理論基礎(chǔ)，是代謝網(wǎng)絡(luò)分析的基本方法[3]。

為了使大腸桿菌中心代謝流能更多地進(jìn)入色氨酸合成的代謝途徑，我們用基因重組技術(shù)構(gòu)建了轉(zhuǎn)酮酶基因（tktA）和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（ppsA）過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEML03[4]，增加色氨酸前體物質(zhì)4-磷酸赤蘚糖（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的濃度，從而提高色氨酸產(chǎn)量。利用Red重組技術(shù)敲除貯碳因子基因（csrA），增加色氨酸前體物質(zhì)PEP的供應(yīng)量，并在原菌株和敲除csrA基因的菌株中分別轉(zhuǎn)入pEML03，再對(duì)上述菌株進(jìn)行30 L分批發(fā)酵試驗(yàn)，考察基因重組對(duì)色氨酸發(fā)酵過(guò)程的影響。通過(guò)測(cè)定在擬穩(wěn)態(tài)下主要代謝物濃度的變化速率，得到了原菌株和重組菌株L-色氨酸合成的代謝流量分布圖，通過(guò)對(duì)主要路徑和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的代謝流分析，闡述了基因操作對(duì)L-色氨酸合成代謝流的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

L-色氨酸生產(chǎn)菌TRTH0709（E.coliK12 ΔcsmΔtrpRΔtna/pSV-709）、TRTH1013（TRTH0709含有tktA和ppsA共表達(dá)質(zhì)粒pEML03）、TRTH1105（TRTH0709ΔcsrA）、TRTH1107（TRTH1105含有質(zhì)粒pEML03）由天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。酵母粉、蛋白胨（OXOID公司）；Na2SO4、CuSO4·7H2O等其他培養(yǎng)基試劑（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；色氨酸、丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸等（Sigma公司）；2，4-二硝基氟苯（天津德宇生物技術(shù)公司）；5 L、30 L發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備工程有限公司）；氨基酸專(zhuān)用色譜柱（C18，5 μm，250 mm× 4.6 mm，No.20200031）。

1.2 搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)

[5]。

1.3 分析方法

菌體生物量、菌體比生長(zhǎng)速率μ、葡萄糖濃度、L-色氨酸含量測(cè)定見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]；氨基酸的檢測(cè)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-色氨酸發(fā)酵過(guò)程曲線

發(fā)酵過(guò)程中每隔2 h取樣測(cè)定菌體的生物量、葡萄糖消耗量及L-色氨酸的生成量。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中以上參數(shù)的變化情況曲線見(jiàn)圖1，可以看出TRTH1013在生長(zhǎng)早期，生長(zhǎng)速度略低于出發(fā)菌，但在中后期能維持較高生長(zhǎng)速度，最高生物量與TRTH0709相比僅低1.8%，最終色氨酸的產(chǎn)量達(dá)到40.2 g/L，增長(zhǎng)幅度為11.9%。TRTH1105在對(duì)數(shù)期與原菌株生長(zhǎng)速度幾乎一致，到達(dá)穩(wěn)定期后菌體增速大于原菌株，最高菌體量達(dá)到49.0 g/L，比原菌株提高2.9%，色氨酸產(chǎn)量為37.7 g/L，與原始菌株相比提高了5%。TRTH1107的最大生物量為48.5%，比原菌株提高1.9%，色氨酸最終積累量為41.2 g/L，比原菌株提高了15.1%。

從圖1還可看出，發(fā)酵進(jìn)入26 h后，菌體數(shù)量基本不再增長(zhǎng)，色氨酸在26～28 h期間處于高速增長(zhǎng)期，同期耗糖速度也較快。將這段時(shí)間假設(shè)為擬穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度為零，胞內(nèi)代謝物濃度變化為零。

2.2 重組菌株與出發(fā)菌株的代謝流分析比較

圖1 出發(fā)菌株和重組菌株的分批發(fā)酵試驗(yàn)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-10]，大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)包括糖酵解（EMP）、三羧酸（TCA）循環(huán)、磷酸戊糖（HMP）途徑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）催化的回補(bǔ)途徑、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）及乙酸、乳酸等代謝副產(chǎn)物的積累。因發(fā)酵控制采用零殘?zhí)橇骷庸に?，在進(jìn)入穩(wěn)定期后，幾乎無(wú)溢流代謝物乙酸、乳酸的積累，因此不考慮乙酸、乳酸的生成途徑。本研究所用菌種為苯丙氨酸和酪氨酸缺陷型，因此代謝途徑中不考慮苯丙氨酸和酪氨酸合成支路。結(jié)合上述分析，建立代謝網(wǎng)絡(luò)。分別測(cè)定并計(jì)算擬穩(wěn)態(tài)時(shí)期26～28 h的葡萄糖消耗速率、色氨酸生成速率及發(fā)酵液中能夠檢測(cè)到的丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和組氨酸的濃度變化速率（表1），分別轉(zhuǎn)換成摩爾流量后，以葡萄糖的代謝流為100進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，用MATLAB軟件計(jì)算代謝流分布。初步計(jì)算表明各供試菌株在色氨酸發(fā)酵中后期由中心代謝途徑r8提供的NADPH已完全能夠滿(mǎn)足氨基酸合成的需要，G6P到Ru5P的反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，r10的計(jì)算結(jié)果均為負(fù)值，不符合代謝的生化熱力學(xué)。在這種情況下r10的反應(yīng)被關(guān)閉[11-12]，因此設(shè)定r10為零，在代謝流計(jì)算時(shí)也不考慮NADPH節(jié)點(diǎn)處的反應(yīng)平衡式。在此前提下，建立的方程組包括20個(gè)方程、26個(gè)未知數(shù)，自由度為6，根據(jù)已知參數(shù)用MATLAB軟件計(jì)算，實(shí)際代謝流分布如圖2所示。

代謝流分析結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)tktA和ppsA（TRTH1103），使EMP（r3）途徑代謝流減少1.6%，HMP（r11）途徑增加9.6%，TCA循環(huán)（r8，r9）減少了7.0%，最終使色氨酸生成途徑代謝流增加了13.3%。敲除csrA基因（TRTH1105），EMP途徑代謝流幾乎未變，HMP途徑增加1.3%，TCA循環(huán)增加了1.4%，最終使色氨酸生成途徑代謝流增加了2.1%。在csrA基因敲除菌中轉(zhuǎn)入tktA和ppsA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（TRTH1107），使EMP途徑代謝流減少4.0%，HMP途徑增加13.6%，TCA循環(huán)減少了8.0%，最終使色氨酸生成途徑代謝流增加了15.7%。從以上分析數(shù)據(jù)可以看出，ppsA和tktA分別對(duì)PEP和E4P的生成起關(guān)鍵作用，2種基因的共同表達(dá)能顯著影響中心代謝流，使其轉(zhuǎn)向色氨酸的生成途徑。敲除csrA基因，會(huì)對(duì)直接或間接參與PEP代謝的若干酶產(chǎn)生影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)PEP水平提高[13]。以往研究指出[14]，僅憑借PEP胞內(nèi)濃度的增加對(duì)色氨酸產(chǎn)量不會(huì)有太大影響，需要同時(shí)使色氨酸合成的另一個(gè)重要的限制性底物E4P的濃度與PEP相平衡，才能進(jìn)一步提高色氨酸合成。而tktA和ppsA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入令PEP和E4P的濃度同時(shí)增加，PEP除了與E4P一起進(jìn)入色氨酸合成途徑外，還會(huì)分流轉(zhuǎn)化為PYR，進(jìn)入TCA循環(huán)或通過(guò)PEP羧化酶催化合成草酰乙酸，并且主要參與PTS葡萄糖的運(yùn)輸。與PEP相比，E4P沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)途徑分流。所以，2個(gè)前體物質(zhì)中PEP可能存在供應(yīng)不足的問(wèn)題，csrA基因的敲除會(huì)進(jìn)一步補(bǔ)充PEP的供應(yīng)量。從TRTH1107的代謝流分析可以看出，2種遺傳標(biāo)記的疊加使色氨酸代謝流進(jìn)一步增加，達(dá)到了15.7%。

表1 代謝產(chǎn)物變化速率（26～28 h）（P＜0.05）

圖2 出發(fā)菌株和重組菌株色氨酸合成的代謝流分布

從連接中心代謝途徑和色氨酸生成途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)PEP處的流量分配可以看出，PEP生成OAA的流量，tktA和ppsA過(guò)表達(dá)菌減少了20%，csrA基因的敲除菌減少了33%，二者標(biāo)記疊加后減少了47%；由PYR生成PEP的量，3株重組菌分別增加了58%、6.5%和70%。同樣說(shuō)明tktA和ppsA過(guò)表達(dá)顯著加強(qiáng)了PYR逆轉(zhuǎn)生成PEP的流量，單純敲除csrA基因?qū)α髁康挠绊戄^小，但在tktA過(guò)表達(dá)的情況下可以明顯加大由PYR生成PEP的流量。以上2項(xiàng)流量分配的變化，有力地促進(jìn)了PEP進(jìn)入色氨酸合成途徑的代謝流量。另外，從副產(chǎn)物氨基酸的流量變化的逐漸降低，也可證實(shí)tktA、ppsA的過(guò)表達(dá)和csrA的敲除對(duì)出發(fā)菌株的色氨酸基因改造是成功的。

3 結(jié)論

綜合以上代謝流的分析結(jié)果可以看出，針對(duì)大腸桿菌中心代謝途徑的基因操作，tktA和ppsA的過(guò)表達(dá)、csrA的敲除，以及二者的疊加，均能有效改變中心代謝途徑的流量，并增加L-色氨酸生成的代謝流。但tktA和ppsA過(guò)表達(dá)的影響更為顯著，雖然csrA的敲除對(duì)各代謝途徑影響不大，但可以適當(dāng)補(bǔ)充因分流而造成的PEP的不足，在質(zhì)粒pEML03存在的情況下能顯著增加L-色氨酸生成的代謝流。從各副產(chǎn)物的流量分析也可以看出仍有繼續(xù)使其降低的必要。另外，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（PTS）消耗了大量PEP，因此對(duì)ATP的需求較大使TCA循環(huán)的代謝流比例較大，碳代謝流主要消耗在TCA循環(huán)，使色氨酸生成途徑的碳代謝流偏低，尋求不消耗PEP的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)代替PTS，能夠較好地解決這個(gè)問(wèn)題。

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