李強(qiáng)，劉先凱，馮爾玲，朱力，王沛，王紅，楊新華，趙美玲，姜永強(qiáng)，王恒樑

1.白求恩醫(yī)務(wù)士官學(xué)校，河北 石家莊 050081；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.生物工程研究所；b.微生物流行病研究所，北京 100071

炭疽芽胞桿菌（Bacillus anthracis）的芽胞侵入動(dòng)物或人體可引起包括皮膚炭疽、胃腸道炭疽、肺炭疽在內(nèi)的3種類型的炭疽疾病，并可被巨噬細(xì)胞吞噬而萌發(fā)，最終入血導(dǎo)致敗血癥，是一種非常重要的人畜共患病病原體[1]。炭疽桿菌的芽胞對(duì)繁殖體形式不易生存的環(huán)境，如干燥、高溫、紫外線、電離輻射、極端pH值等的抵抗力極強(qiáng)，提高了菌體感染人或動(dòng)物的幾率；且炭疽桿菌的芽胞是其主要感染形式，并可制備為氣溶膠而大面積擴(kuò)散，成為生物戰(zhàn)劑的首選。2001年10月發(fā)生的生物恐怖襲擊中使用了炭疽芽胞，引起了全世界對(duì)于炭疽桿菌芽胞研究的關(guān)注[2]。

細(xì)菌芽胞形成是菌體分裂的一種特殊形式。我們前期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)FtsE蛋白在炭疽桿菌芽胞形成過程中明顯上調(diào)，提示其可能在芽胞形成過程中發(fā)揮了重要作用[3]。Garti-Levi等在枯草芽胞桿菌芽胞形成研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tsE蛋白不僅可作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子攝取外界環(huán)境信號(hào)，激活Spo0A并起始芽胞形成過程，而且對(duì)芽胞形成過程中的不對(duì)稱分裂起到了關(guān)鍵作用[4]。

為研究炭疽芽胞桿菌中FtsE蛋白的功能，我們利用基因工程技術(shù)將其編碼序列克隆到原核表達(dá)載體，進(jìn)行了可溶性誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化了親和層析法大量純化FtsE蛋白的條件，獲得了高純度目的蛋白，為下一步功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

炭疽桿菌減毒株A16R由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院菌種中心提供；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）和表達(dá)載體pET-28a為本室保存；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；鼠源抗-His抗體購自Pharmacia公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸訮romega公司；蛋白定量試劑盒購自Amer?sham公司；蛋白胨與酵母提取物購自O(shè)XOID公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自BBI公司；PEG20000、過硫酸銨、TEMED、EDTA二鈉鹽、十二烷基磺酸鈉（SDS）、考馬斯亮藍(lán)G-250、RNase A等購自AMRESCO公司。

低溫離心機(jī)為SIGMA 3K12；酶聯(lián)檢測(cè)儀型號(hào)為SS-3000；超聲破碎儀為SONICS VC 750型；國產(chǎn)脫色搖床；GeneAmp PCR system為Applied Biosys?tems產(chǎn)品；凝膠成像分析儀為TANSILLUMNATOR公司產(chǎn)品；垂直電泳儀購自Amersham公司；蛋白半干電轉(zhuǎn)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；AKTA FPLC及 Ni-NTA產(chǎn)自Pharmacia公司。

1.2 構(gòu)建融合表達(dá)載體pET28a-ftsE

調(diào)取GenBank中炭疽芽胞桿菌ftsE基因序列，利用Primer premier軟件，于此基因上下游末端分別插入EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物（由奧科生物技術(shù)公司合成）F（5'-CCGGAATTCATGAAAGCC ATTGCTGGTCT-3'）和 R（5'-CCCAAGCTTGCCTTC ATATCCGTATCCTC-3'）。

PCR擴(kuò)增（50 μL反應(yīng)體系）參數(shù)為94℃ 變性10 min，之后以94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物及pET28a質(zhì)粒分別于37℃水浴條件下用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切6 h，用凝膠回收試劑盒回收后在凝膠成像分析儀下定量；根據(jù)Novagen pET system Man?ual，配制擴(kuò)增產(chǎn)物與pET載體連接反應(yīng)體系，16℃反應(yīng)過夜；將2 μL重組連接反應(yīng)產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到33 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)后涂LB（Kan+）平板，分別挑取數(shù)個(gè)pET-ftsE轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定；對(duì)陽性克隆純培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒由奧科公司測(cè)序鑒定。

1.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與Western印跡鑒定

將pET-ftsE重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21（DE3），獲得表達(dá)外源蛋白的重組大腸桿菌BL21（pET-ftsE），挑取LB（Kan+）平板上的單個(gè)重組菌落，接種于5 mL LB（Kan+）液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h，然后取1%接種到新鮮LB（Kan+）液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)140 min后，加入不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2～4 h，離心收集菌體，煮沸5 min后12 000 r/min離心2 min，取5 μL樣品行SDS-PAGE，80 V恒壓電泳20 min后，120 V恒壓電泳3 h，取凝膠置于染色液中染色30 min，然后用高甲醇脫色液（45%甲醇，47%水，8%冰乙酸）脫色2 h，低甲醇脫色液（5%甲醇，87%水，8%冰乙酸）脫色4 h，觀察融合蛋白的表達(dá)情況。

取微量融合蛋白與等體積2×SDS緩沖液充分混勻，煮沸5 min，離心后取12 μL上樣電泳，將分離的蛋白通過半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，恒壓15 V轉(zhuǎn)移1.5 h；用5%脫脂奶粉封閉1 h后，以抗-His抗體為一抗，室溫封閉1.5 h，洗膜3次后以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫封閉后吸凈PVDF膜表面液體，ECL顯色系統(tǒng)顯色5 min后用X線膠片在暗室中曝光檢測(cè)目的蛋白。

1.4 優(yōu)化融合蛋白的可溶性表達(dá)

分別在14、20、30℃條件下用終濃度分別為0.1、0.4、0.5、1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)1～4 h，對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物的上清及沉淀分別行SDS-PAGE檢測(cè)，篩選融合蛋白可溶性表達(dá)的條件。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物的鎳柱純化

按照篩選的誘導(dǎo)條件，將表達(dá)融合蛋白的工程菌用IPTG誘導(dǎo)3 h，將2000 mL培養(yǎng)液于4℃條件下8000 r/min離心15 min，收集菌體，重懸于20 mL Ni-NTA柱結(jié)合緩沖液中，加入蛋白酶抑制劑，在30%總功率條件下，冰浴超聲波破碎20 min（超聲2 s，停2 s），4℃、5000 r/min離心30 min，收集上清。

依次用8倍柱體積的雙蒸水、4倍柱體積的1 mol/L NaCl、16倍柱體積的雙蒸水、8倍柱體積的結(jié)合緩沖液緩?fù)七^Ni-NTA柱，置4℃冰箱中備用。

處理好的柱子UV約為50，上樣3 mL/min至總體積200 mL；用Ni-NTA柱結(jié)合緩沖液洗柱3 mL/min，至UV為52；用Ni-NTA柱洗滌緩沖液洗柱3 mL/min，至UV為56；分別用3.3%、10%、20%、30%、50%、70%、100%的洗脫緩沖液洗5個(gè)柱體積，收集液體，每管收集1 mL洗脫液，每隔5管取少量洗脫液進(jìn)行電泳驗(yàn)證，檢測(cè)純化蛋白的純度和蛋白量。

2 結(jié)果

2.1 ftsE基因的PCR擴(kuò)增

GenBank中ftsE基因片段長度為645 bp。由圖1可見，擴(kuò)增出的片段長度與預(yù)計(jì)相符。

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-ftsE的構(gòu)建

將表達(dá)載體pET28a與ftsE基因的PCR產(chǎn)物分別雙酶切后，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pET28a-ftsE用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，結(jié)果如圖2，1、2、4泳道出現(xiàn)2條電泳帶，其中一條分子大的電泳帶與載體pET-28a位置相同，另一條分子小的電泳帶則位于600 bp左右，與ftsE基因的PCR產(chǎn)物大小相同。

2.3 重組質(zhì)粒中ftsE基因的核苷酸序列分析

對(duì)酶切鑒定正確的菌株傳代保存，并挑取單菌落培養(yǎng)10 h后，取1.5 mL菌液送奧科公司測(cè)序。測(cè)得的ftsE基因的核苷酸序列與GenBank中BA5416序列相同，編碼框架完全正確。

2.4 重組蛋白的SDS-PAGE分析及Western印跡

含重組質(zhì)粒pET-ftsE的大腸桿菌BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，于4℃、5000 r/min離心取菌體，溶解于Ni-NTA柱結(jié)合緩沖液后超聲波破碎，10 000 r/min離心后分別取上清和包涵體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析重組FtsE蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)情況。取微量融合蛋白以抗-His抗體進(jìn)行Western印跡，發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達(dá)正確（圖3）。進(jìn)一步對(duì)表達(dá)的溫度和誘導(dǎo)的IPTG濃度等條件進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)在20℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下的表達(dá)產(chǎn)物主要是可溶性蛋白。

圖1 PCR擴(kuò)增得到ftsE基因

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.5 重組FtsE蛋白的分離純化

經(jīng)過不斷摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件，在20℃，0.1 mmol/L條件下表達(dá)的FtsE主要以可溶性形式存在。將制備得到的全菌體溶液上清用Ni-NTA純化進(jìn)行親和層析，然后用不同濃度的咪唑洗脫緩沖液梯度洗脫得到純化產(chǎn)物，共得到80管液體，每管1 mL，從中取微量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖4。

3 討論

對(duì)大腸桿菌的FtsE蛋白的大量研究表明，其通過參與構(gòu)建并穩(wěn)固菌體分裂環(huán)及水解細(xì)胞壁，在菌體細(xì)胞分裂中發(fā)揮了重要作用，是菌體分裂相關(guān)蛋白[5-6]。對(duì)肺炎球菌FtsE蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，其通過與PCB蛋白的相互作用，參與細(xì)胞分裂[7]。對(duì)腦膜炎球菌FtsE蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，其通過與DNA結(jié)合，參與攝取外源DNA而進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化[8]。對(duì)枯草芽胞桿菌芽胞形成的研究認(rèn)為，F(xiàn)tsE蛋白作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子，參與攝取外源信號(hào)物質(zhì)，起始芽胞形成過程，并在芽胞形成過程中參與細(xì)胞的不對(duì)稱分裂，是芽胞形成中不可或缺的重要蛋白[4]。

炭疽芽胞桿菌中FtsE蛋白的功能還不清楚，因此，我們構(gòu)建了炭疽芽胞桿菌ftsE基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行了融合表達(dá)。因?yàn)橥庠幢磉_(dá)的可溶性蛋白具有易分離、活性高、與體內(nèi)狀態(tài)更接近的特點(diǎn)，我們摸索了FtsE蛋白的可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件，并利用Pharmacia公司的FPLC及Ni-NTA對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，獲得了純度達(dá)90%以上的融合蛋白，為下一步抗體制備及其體內(nèi)外功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)（左）及Western印跡（右）

圖4 純化洗脫FtsE蛋白的SDS-PAGE

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