宮紅梅

【摘要】本文綜述了高效毛細管電泳的分離原理及模式，蛋白質(zhì)的分離特性及抑制吸附的方法，電滲流的影響因素和控制方法。

【關(guān)鍵詞】高效毛細管電泳;蛋白質(zhì);電滲流

1.背景

毛細管電泳法由于其特有的快速，高效，簡單，成本低等特點也越來越多的應(yīng)用于蛋白質(zhì)的研究中，如多肽的分析，蛋白質(zhì)的細微結(jié)構(gòu)差異分析，以及鑒定蛋白質(zhì)的純度，蛋白質(zhì)反應(yīng)動力學(xué)過程，測定蛋白質(zhì)的分子量等[1]。

2.毛細管電泳在蛋白分離中的應(yīng)用

2.1 高效毛細管電泳用于蛋白質(zhì)分離的模式

（1）毛細管區(qū)帶電泳：HPCE中最簡單的、應(yīng)用最廣泛的一種方式，毛細管內(nèi)只充入緩沖溶液，分離過程中電滲流由毛細管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動起著主導(dǎo)作用。一組化合物中，陽離子遷移最快，中性物質(zhì)居中，而陰離子速度最慢。被分析物中各化合物帶電荷數(shù)差別越大，相對分子質(zhì)量的差別越大，分離度越大，但所有的中性物質(zhì)彼此不能分離。

（2）膠束電動毛細管色譜（MECC或MEKC）：結(jié)合了電泳技術(shù)與色譜技術(shù)，也是HPCE中應(yīng)用最廣的方式之一。MECC是唯一的既能分離中性組分又能分離帶電組分的電泳技術(shù)。其原理是在緩沖溶液中加入表面活性劑，如果表面活性劑的濃度達到臨界濃度，則表面活性劑單體就結(jié)合在一起形成膠束。在緩沖液中添加的表面活性劑具有吸附、增溶、形成膠束等功能，因此增加了該模式分離化合物的范圍[2]。

（3）毛細管凝膠電泳（GCE）：毛細管內(nèi)填充凝膠或其他篩分介質(zhì)，荷質(zhì)比相同但大小不同的分子，在電場力的推動下經(jīng)凝膠聚合物構(gòu)成的網(wǎng)狀介質(zhì)中電泳受到的阻力不同達到分離。鑒于凝膠的一些缺點，最近有高分子聚合物代替凝膠，在毛細管中形成動態(tài)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，溶質(zhì)在網(wǎng)格中發(fā)生相對移動，從而依靠分子大小進行分離，即無膠篩分毛細管電泳（NGSCE）。

（4）毛細管等電聚焦（CIEF）：當兩性物質(zhì)在毛細管中形成pH梯度時，不同等電點的物質(zhì)在外電場作用下向等電點的pH值范圍遷移，當溶質(zhì)遷移到等于其等電點范圍時，就不再移動，形成一個窄的溶質(zhì)帶，使具有不同等電點的蛋白質(zhì)可以分離。

2.2 蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)及對分離的影響

蛋白質(zhì)是由氨基酸通過酰胺鍵連接而成的高分子，氨基酸屬兩性分子，并有堿性、中性、酸性之分。對應(yīng)的蛋白質(zhì)也是兩性物質(zhì)，亦有堿性、中性和酸性之分。蛋白質(zhì)因其折迭方式、空間結(jié)構(gòu)和修飾基因等的不同，還有親水或疏水之分。兩性物質(zhì)所帶凈電荷為零時的pH值稱等電點pI。當所處環(huán)境大于等電點時，兩性物質(zhì)帶負電荷;當所處環(huán)境小于等電點時，兩性物質(zhì)帶正電荷。在CZE分離蛋白質(zhì)混合物時，由于蛋白質(zhì)所帶的電荷種類和密度不同達到分離[3]。但是，毛細管的表面硅羥基解離，帶負電荷，在分離的蛋白質(zhì)的等電點大于電泳緩沖液的pH值時，會產(chǎn)生靜電吸附，除了硅醇負離子，融硅表面還會產(chǎn)生各種活性位點，如惰性硅氧橋和氫鍵位點，這些活性位點都會參與蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水區(qū)與管內(nèi)壁的作用，因此很容易出現(xiàn)吸附問題，尤其是對堿性蛋白質(zhì)。此外，由于毛細管內(nèi)壁的不均一性，容易對蛋白質(zhì)產(chǎn)生物理吸附，當分析物濃度在0.1-1.0mg/ml時，影響非常嚴重。不管是物理吸附還是化學(xué)吸附，都會導(dǎo)致峰拖尾，展寬，使分離效率下降，分離時間延長，重現(xiàn)性差，甚至電滲流消失，嚴重影響分離。因此，吸附問題是分離過程中要首要解決的[4]。

2.3 常用的解決吸附問題的方法

（1）采用極端pH值（pH8～11或pH<2）的緩沖溶液。Righetti等在pH值2.0-2.5時，為了克服高電導(dǎo)而不能加高電壓地缺點，提出了一種采用等電緩沖液的辦法，實現(xiàn)了僅一個中性氨基酸不同的兩條球蛋白鏈基線分離[5]。

（2）采用無機和有機添加劑的方法，緩沖液中含有高濃度的中性鹽，有機添加劑如二胺類、兩性電解質(zhì)等都能競爭吸附位點，從而有效地抑制蛋白質(zhì)的吸附。

（3）樣品處理：典型方法是用表面活性劑SDS，SDS結(jié)合變性的蛋白，消除了蛋白質(zhì)本身的電荷量影響，使蛋白質(zhì)依靠分子量大小得以分離。

（4）對毛細管內(nèi)壁進行改性：主要是指采用物理涂敷或化學(xué)鍵合以及交聯(lián)等方法，在毛細管壁形成單分子層或交聯(lián)的涂層。通過涂層來阻止蛋白質(zhì)與毛細管壁的相互作用，以達到減小蛋白質(zhì)吸附的目的。由于涂層改變了毛細管壁的狀態(tài)，因而也會引起電滲流的變化。電中性的涂層會抑制電滲流，若是帶正電的高分子涂層則會使電滲流減小甚至反轉(zhuǎn)[6]。

（5）針對不同的被分析物，還有其他的抑制吸附的方法。任吉存，鄧延倬等在緩沖液中添加賴氨酸和精氨酸，它們在中性或微堿性的緩沖液里帶正電荷，能和帶負電的管壁靜電吸引結(jié)合，抑制了硅醇的解離，使相對遷移時間和相對峰高的重現(xiàn)性增強[7]。

毛細管電泳研究中，探索新的分離介質(zhì)和新的分離模式可以提高分離效率和毛細管電泳的適用范圍[8，9]，這方面的研究工作一直在進展中。

3.結(jié)束語

毛細管電泳分離蛋白質(zhì)具有其高效，快速，樣品量少，溶劑量少等特點，但對于實際蛋白質(zhì)研究還存在一些問題，如吸附問題，分辨率問題，復(fù)雜組分的干擾等。各種新的分離模式和探索正在進行中。

參考文獻

[1]李林，吳家睿.蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生及其重要意義[J].生命科學(xué)，1999，11（2）：49-50.

[2]孔毅，吳如金.高效毛細管電泳及其在蛋白質(zhì)、多肽分析中的應(yīng)用[J].藥學(xué)進展[J].2000，24（4）：204-208.

[3]屠紅旻，夏其昌.毛細管電泳及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用[J].生命的化學(xué)，1994，14（6）：36-39.

[4]李敏.高效毛細管電泳中的電滲流及控制[J].淮北煤師院學(xué)報，2000，21（2）：39-42.

[5]張蕊，郭寶林.高效毛細管電泳技術(shù)用于生物堿的分析[J].中草藥2005，36（2）：1889-1892.

[6]S.P.Radko.CapillaryElectrophoresis.Proteins.AcademicPress.2000：4009-4014.

[7]Righetti P G，Bossi A，Olivieri E，Gelfi C.J.Biochem.Biophys.Methods，1999.

[8]康經(jīng)武，陸豪杰.毛細管電泳涂層柱技術(shù)的進展[J].色譜，1998，16（1）：26-29.

[9]劉玉，顧峻領(lǐng).聚合物涂層毛細管柱分離蛋白質(zhì)的研究[J].北京理工大學(xué)學(xué)報，1995，4（2）：155-163.