張一云 唐 菲 高 雨 侯世封* 楊麗娜

1.海南省藥物研究所，海南 海口 571100;2.海南黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會(huì)，海南 ?？?572200

黎族民間醫(yī)藥作為中國(guó)傳統(tǒng)民族用藥的一種，用藥歷史具有3000多年［1］，但由于信息溝通方面的問(wèn)題，一直未能得到有效的傳承和發(fā)展［4］。本課題研究的是黎族杞方言地區(qū) (五指山)藥王使用的通瘀去炎湯，由黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會(huì)楊麗娜女士提供，該方由4味藥組成，原植物皆產(chǎn)在海拔100～500米的丘陵和山地，在當(dāng)?shù)刂髦胃黝惣毙匝装Y及內(nèi)外出血。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該方，對(duì)處方進(jìn)行了急性毒性研究和藥效學(xué)的初步研究，為該方的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM小鼠，體重18～20g，雌雄各半，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(湘)2009-0012，SPF動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 通瘀去炎湯由4味藥組成，取通瘀去炎湯處方藥材粉碎，用8倍量的水提取半小時(shí)，濾過(guò)，余下的藥渣用6倍量的水繼續(xù)提取半小時(shí)，合并濾液，濃縮至2g/ml(每ml含生藥材2g)，備用;云南白藥膠囊，0.25g/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字Z53020799，由云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):ZBA1305;阿莫西林克林維酸鉀片:片劑，0.375g/片，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20043183，由石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):160130108。

1.1.3 試劑及儀器 二甲苯、50ul移液槍、生物通風(fēng)安全柜、離心機(jī)、顯微鏡、灌胃針、干凈載玻片、剪刀、鑷子、1ml注射針、生理鹽水、瑞氏染液、1%雞紅細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)［2-3］經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，按最大體積 (40ml/kg)，最大濃度 (2g/ml)灌胃給藥小鼠，未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡，遂進(jìn)行最大給藥量實(shí)驗(yàn)。取18～20gKM種小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分成兩組，即正常對(duì)照組和通瘀去炎湯組，每組20只，于實(shí)驗(yàn)前禁食1晚，通瘀去炎湯組按40ml/kg體重，2g/ml藥物濃度，一天內(nèi)灌服2次，正常對(duì)照組灌服等量容積的蒸餾水，給藥后連續(xù)觀察14d小鼠的活動(dòng)、體重及飲食狀況，并詳細(xì)記錄，計(jì)算最大給藥量。選擇最大給藥量的1/10、1/20、1/40分別作為藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)藥物的高、中、低劑量組。

1.2.2 抗急性炎癥實(shí)驗(yàn)［2-3］取健康昆明種小鼠，18～20g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只動(dòng)物，即空白對(duì)照組 (給以相應(yīng)容積的蒸餾水)、阿莫西林克林維酸鉀片組 (0.21g/kg)、通瘀去炎湯高劑量組 (16g/kg)、中劑量組 (8g/kg)、低劑量組 (4g/kg)，小鼠按0.2ml/10g/d灌胃給藥1次，連續(xù)給藥4d，末次給藥30min后，以移液槍在小鼠右耳涂以二甲苯0.05ml/只，左耳作為對(duì)照不進(jìn)行任何處理，15min后處死動(dòng)物，用直徑8mm的打孔器將左右雙耳同部位等面積切下，以萬(wàn)分之一天平精密稱量，按以下公式計(jì)算并比較腫脹值、腫脹率及抑制率，，以此評(píng)價(jià)藥物的抗炎作用:腫脹值=右耳片重量-左耳片重量;腫脹率 (%)=(腫脹值/左耳重量) ×100%;抑制率 (%)=(給藥組平均腫脹率-對(duì)照組平均腫脹率)/對(duì)照組平均腫脹率×100%。

1.2.3 止血實(shí)驗(yàn)［2-3］取健康昆明種小鼠，18～20g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只動(dòng)物，即空白對(duì)照組(給以相應(yīng)容積的蒸餾水)、云南白藥組 (0.26g/kg)、通瘀去炎湯高劑量組 (16g/kg)、中劑量組 (8g/kg)、低劑量組(4g/kg)，各組小鼠按0.2ml/10g/d灌胃給藥1次，連續(xù)給藥4d，末次給藥30min后，用毛細(xì)管從小鼠球后靜脈叢取血于載玻片，血滴直徑約為5mm，立即用秒表計(jì)時(shí)。每隔10s(second)用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕挑動(dòng)一次，并觀察有無(wú)血絲挑起。從采血開(kāi)始至挑起血絲止為凝血時(shí)間，比較各組凝血時(shí)間的差異。

1.2.4 化瘀實(shí)驗(yàn)［2-3］取健康昆明種小鼠，18～20g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只動(dòng)物，即空白對(duì)照組(給以相應(yīng)容積的蒸餾水)、云南白藥組 (0.26g/kg)、通瘀去炎湯高劑量組 (16g/kg)、中劑量組 (8g/kg)、低劑量組 (4g/kg)，各組小鼠按0.2ml/10g/d灌胃給藥1次，連續(xù)給藥5d。給藥第2天開(kāi)始腹腔注射6%淀粉溶液1ml，連續(xù)3d。末次給藥后，小鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液2ml，輕揉腹部使之分散。30min后脫椎處死小鼠，腹腔注射生理鹽水2ml，剪開(kāi)腹部用吸管吸取腹腔液，滴加一滴于干凈載玻片上，再滴加一滴生理鹽水稀釋。10min后棄去生理鹽水，待標(biāo)本稍微干燥，在其上滴加3～4滴瑞氏染液染色5min，甩去染液，蒸餾水溫柔沖洗，晾干后置于顯微鏡下觀察。觀察并統(tǒng)計(jì)40X鏡下5個(gè)視野內(nèi)的巨噬細(xì)胞的總數(shù)、吞噬了紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)及每個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬的紅細(xì)胞數(shù)。按照如下公式計(jì)算并比較吞噬率及吞噬指數(shù)。吞噬率=(吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞/總計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞)×100%;吞噬指數(shù)=總吞噬的紅細(xì)胞數(shù)/吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) (最大給藥量試驗(yàn))在無(wú)法測(cè)出小鼠LD50情況下，進(jìn)行了最大給藥量實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中觀察到正常對(duì)照組和通瘀去炎湯組小鼠均于給藥后10min內(nèi)活動(dòng)稍有緩慢，30min恢復(fù)正常，給藥14天內(nèi)，動(dòng)物均無(wú)死亡，活動(dòng)及飲食皆正常，眼、鼻、口無(wú)粘液性分泌物。對(duì)體重和進(jìn)食量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。計(jì)算最大給藥量為 160g/kg，相當(dāng)于臨床人日用生藥量 (即生藥0.5g/kg體重)的320倍。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 通瘀去炎湯最大給藥量對(duì)小鼠體重的影響 (±s)

表1 通瘀去炎湯最大給藥量對(duì)小鼠體重的影響 (±s)

組別 劑量g/kg動(dòng)物數(shù)(只)給藥前體重(g)給藥后體重 (g)第7d 第14d正常對(duì)照組- 20 19.78 ±1.23 24.88 ±1.56 31.99 ±2.75通瘀去炎湯組160 20 19.55 ±1.43 25.25 ±1.98 32.48 ±2.76

表2 通瘀去炎湯最大給藥量對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響 (±s)

表2 通瘀去炎湯最大給藥量對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響 (±s)

組別 劑量g/kg動(dòng)物數(shù)(只)給藥前日進(jìn)食(g)給藥后日進(jìn)食量 (g)第7d 第14d正常對(duì)照組- 20 7.67 ±1.76 9.13 ± 2.88 11.11 ± 2.54通瘀去炎湯組160 20 7.58 ±2.13 9.65 ± 2.34 11.43 ± 2.79

2.2 抗急性炎癥實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);通瘀去炎組高、中、低劑量 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)與阿莫西林克林維酸鉀片 (0.21g/kg)效果相當(dāng)，組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 通瘀去炎湯對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s)

表3 通瘀去炎湯對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)(只)腫脹率(%)空白對(duì)照組- 10 95.69 ±36.54阿莫西林克林維酸鉀片組 0.21 10 54.64 ±22.41*通瘀去炎湯高劑量組 16 10 47.43 ±31.04*通瘀去炎湯中劑量組 8 10 53.24 ±29.42*通瘀去炎湯低劑量組 4 10 56.33 ±28.14*

2.3 止血實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能加速小鼠凝血的時(shí)間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05或P＜0.01)。通瘀去炎組高、中、低劑量 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)效果相當(dāng)，組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 通瘀去炎湯對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 (±s)

表4 通瘀去炎湯對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 (±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量 (g/kg)動(dòng)物數(shù) (只)凝血時(shí)間 (min)空白對(duì)照組-10 1.96 ±0.43云南白藥膠囊組 0.26 10 1.36 ±0.31＊＊通瘀去炎湯高劑量組 16 10 1.20 ±0.40＊＊通瘀去炎湯中劑量組 8 10 1.50 ±0.35*通瘀去炎湯低劑量組 4 10 1.52 ±0.30*

2.4 化瘀實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能顯著提升小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力，增加吞噬率與吞噬指數(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。其中通瘀去炎湯高、中劑量 (16 g/kg、8g/kg)的作用強(qiáng)于云南白藥膠囊 (0.26g/kg)，組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);通瘀去炎湯低劑量 (4g/kg)與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)的效果相當(dāng)，組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 通瘀去炎湯對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 (±s)

表5 通瘀去炎湯對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 (±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;與云南白藥膠囊組比較，*P＜0.05

組別 劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)(只) 吞噬率 (%)吞噬指數(shù)空白對(duì)照組- 10 45.87 ±3.29 2.46 ±0.15云南白藥膠囊組 0.26 10 59.17 ±3.41＊＊ 2.92 ±0.18＊＊通瘀去炎湯高劑量組 16 10 68.97 ±3.49＊＊ 4.07 ±0.31＊＊△通瘀去炎湯中劑量組 8 10 62.05 ±3.00＊＊ 3.58 ±0.10＊＊△通瘀去炎湯低劑量組 4 10 57.44 ±2.12＊＊ 2.76 ±0.21＊＊

3 討論

黎族杞方言地區(qū)通瘀去炎湯主要由四味藥材組成，其中一味為海南草珊瑚，其他三種皆為產(chǎn)在海南熱帶雨林地區(qū)較為常見(jiàn)的草藥［5］。本文對(duì)通瘀去炎湯進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)和抗炎、止血、化瘀的藥效學(xué)研究。結(jié)果表明，通瘀去炎湯的最大給藥量為160g/kg，相當(dāng)于臨床人日用生藥量(即生藥0.5g/kg體重)的320倍，安全閾值較高。同時(shí)，通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹 (P＜0.05)、能加速小鼠凝血的時(shí)間 (P＜0.05)、顯著提升小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力，增加吞噬率與吞噬指數(shù) (P＜0.05)。其抗炎作用與與阿莫西林克林維酸鉀片 (0.21g/kg)效果相當(dāng)，止血作用與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)相當(dāng)，而在化瘀作用上，通瘀去炎湯高、中劑量 (16 g/kg、8g/kg)明顯強(qiáng)于云南白藥膠囊 (0.26g/kg)，通瘀去炎湯低劑量 (4g/kg)與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)的效果相當(dāng)。研究結(jié)果提示，本處方具有較好的抗炎止血作用，特別在清除由血管損傷，紅細(xì)胞外溢所引起的淤青和腫脹方面強(qiáng)于云南白藥。而對(duì)于本處方藥效實(shí)驗(yàn)的深入研究、長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究等將在接下來(lái)的工作中進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

［1］《黎族簡(jiǎn)史》編寫(xiě)組.黎族簡(jiǎn)史［M］.廣州:廣東人民出版社，1980.

［2］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:656-658.

［3］徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991.

［4］鄭才成.海南黎藥發(fā)展研究概況［J］.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2007，13(5):2-3.

［5］鄭希龍，陳紅鋒，李榕濤，等.海南潤(rùn)方言黎族藥用民族植物學(xué)研究［J］.云南植物研究，2008，30(2):195-210.

［6］關(guān)亞麗，潘琴，黃敏仁.民族植物學(xué)與海南黎藥資源開(kāi)發(fā)［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版)，2009，33(4):145-149.