張一云 唐 菲 高 雨 侯世封* 楊麗娜

1.海南省藥物研究所，海南 ?？?571100;2.海南黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會，海南 ?？?572200

黎族民間醫(yī)藥作為中國傳統(tǒng)民族用藥的一種，用藥歷史具有3000多年［1］，但由于信息溝通方面的問題，一直未能得到有效的傳承和發(fā)展［4］。本課題研究的是黎族杞方言地區(qū) (五指山)藥王使用的通瘀去炎湯，由黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會楊麗娜女士提供，該方由4味藥組成，原植物皆產(chǎn)在海拔100～500米的丘陵和山地，在當?shù)刂髦胃黝惣毙匝装Y及內外出血。為進一步開發(fā)該方，對處方進行了急性毒性研究和藥效學的初步研究，為該方的臨床應用提供了實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 KM小鼠，體重18～20g，雌雄各半，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號:SCXK(湘)2009-0012，SPF動物房飼養(yǎng)。

1.1.2 實驗藥物 通瘀去炎湯由4味藥組成，取通瘀去炎湯處方藥材粉碎，用8倍量的水提取半小時，濾過，余下的藥渣用6倍量的水繼續(xù)提取半小時，合并濾液，濃縮至2g/ml(每ml含生藥材2g)，備用;云南白藥膠囊，0.25g/粒，國藥準字Z53020799，由云南白藥集團股份有限公司生產(chǎn)，批號:ZBA1305;阿莫西林克林維酸鉀片:片劑，0.375g/片，國藥準字 H20043183，由石藥集團中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn)，批號:160130108。

1.1.3 試劑及儀器 二甲苯、50ul移液槍、生物通風安全柜、離心機、顯微鏡、灌胃針、干凈載玻片、剪刀、鑷子、1ml注射針、生理鹽水、瑞氏染液、1%雞紅細胞。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性試驗［2-3］經(jīng)預實驗，按最大體積 (40ml/kg)，最大濃度 (2g/ml)灌胃給藥小鼠，未發(fā)現(xiàn)動物死亡，遂進行最大給藥量實驗。取18～20gKM種小鼠40只，雌雄各半，隨機分成兩組，即正常對照組和通瘀去炎湯組，每組20只，于實驗前禁食1晚，通瘀去炎湯組按40ml/kg體重，2g/ml藥物濃度，一天內灌服2次，正常對照組灌服等量容積的蒸餾水，給藥后連續(xù)觀察14d小鼠的活動、體重及飲食狀況，并詳細記錄，計算最大給藥量。選擇最大給藥量的1/10、1/20、1/40分別作為藥效學實驗藥物的高、中、低劑量組。

1.2.2 抗急性炎癥實驗［2-3］取健康昆明種小鼠，18～20g，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只動物，即空白對照組 (給以相應容積的蒸餾水)、阿莫西林克林維酸鉀片組 (0.21g/kg)、通瘀去炎湯高劑量組 (16g/kg)、中劑量組 (8g/kg)、低劑量組 (4g/kg)，小鼠按0.2ml/10g/d灌胃給藥1次，連續(xù)給藥4d，末次給藥30min后，以移液槍在小鼠右耳涂以二甲苯0.05ml/只，左耳作為對照不進行任何處理，15min后處死動物，用直徑8mm的打孔器將左右雙耳同部位等面積切下，以萬分之一天平精密稱量，按以下公式計算并比較腫脹值、腫脹率及抑制率，，以此評價藥物的抗炎作用:腫脹值=右耳片重量-左耳片重量;腫脹率 (%)=(腫脹值/左耳重量) ×100%;抑制率 (%)=(給藥組平均腫脹率-對照組平均腫脹率)/對照組平均腫脹率×100%。

1.2.3 止血實驗［2-3］取健康昆明種小鼠，18～20g，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只動物，即空白對照組(給以相應容積的蒸餾水)、云南白藥組 (0.26g/kg)、通瘀去炎湯高劑量組 (16g/kg)、中劑量組 (8g/kg)、低劑量組(4g/kg)，各組小鼠按0.2ml/10g/d灌胃給藥1次，連續(xù)給藥4d，末次給藥30min后，用毛細管從小鼠球后靜脈叢取血于載玻片，血滴直徑約為5mm，立即用秒表計時。每隔10s(second)用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕挑動一次，并觀察有無血絲挑起。從采血開始至挑起血絲止為凝血時間，比較各組凝血時間的差異。

1.2.4 化瘀實驗［2-3］取健康昆明種小鼠，18～20g，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只動物，即空白對照組(給以相應容積的蒸餾水)、云南白藥組 (0.26g/kg)、通瘀去炎湯高劑量組 (16g/kg)、中劑量組 (8g/kg)、低劑量組 (4g/kg)，各組小鼠按0.2ml/10g/d灌胃給藥1次，連續(xù)給藥5d。給藥第2天開始腹腔注射6%淀粉溶液1ml，連續(xù)3d。末次給藥后，小鼠腹腔注射1%雞紅細胞懸液2ml，輕揉腹部使之分散。30min后脫椎處死小鼠，腹腔注射生理鹽水2ml，剪開腹部用吸管吸取腹腔液，滴加一滴于干凈載玻片上，再滴加一滴生理鹽水稀釋。10min后棄去生理鹽水，待標本稍微干燥，在其上滴加3～4滴瑞氏染液染色5min，甩去染液，蒸餾水溫柔沖洗，晾干后置于顯微鏡下觀察。觀察并統(tǒng)計40X鏡下5個視野內的巨噬細胞的總數(shù)、吞噬了紅細胞的巨噬細胞數(shù)及每個巨噬細胞吞噬的紅細胞數(shù)。按照如下公式計算并比較吞噬率及吞噬指數(shù)。吞噬率=(吞噬紅細胞的巨噬細胞/總計數(shù)巨噬細胞)×100%;吞噬指數(shù)=總吞噬的紅細胞數(shù)/吞噬紅細胞的巨噬細胞數(shù)。

2 結果

2.1 急性毒性實驗 (最大給藥量試驗)在無法測出小鼠LD50情況下，進行了最大給藥量實驗。實驗中觀察到正常對照組和通瘀去炎湯組小鼠均于給藥后10min內活動稍有緩慢，30min恢復正常，給藥14天內，動物均無死亡，活動及飲食皆正常，眼、鼻、口無粘液性分泌物。對體重和進食量進行了統(tǒng)計，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。計算最大給藥量為 160g/kg，相當于臨床人日用生藥量 (即生藥0.5g/kg體重)的320倍。結果見表1和表2。

表1 通瘀去炎湯最大給藥量對小鼠體重的影響 (±s)

表1 通瘀去炎湯最大給藥量對小鼠體重的影響 (±s)

組別 劑量g/kg動物數(shù)(只)給藥前體重(g)給藥后體重 (g)第7d 第14d正常對照組- 20 19.78 ±1.23 24.88 ±1.56 31.99 ±2.75通瘀去炎湯組160 20 19.55 ±1.43 25.25 ±1.98 32.48 ±2.76

表2 通瘀去炎湯最大給藥量對小鼠進食量的影響 (±s)

表2 通瘀去炎湯最大給藥量對小鼠進食量的影響 (±s)

組別 劑量g/kg動物數(shù)(只)給藥前日進食(g)給藥后日進食量 (g)第7d 第14d正常對照組- 20 7.67 ±1.76 9.13 ± 2.88 11.11 ± 2.54通瘀去炎湯組160 20 7.58 ±2.13 9.65 ± 2.34 11.43 ± 2.79

2.2 抗急性炎癥實驗 實驗結果表明，與空白對照組比較，通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);通瘀去炎組高、中、低劑量 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)與阿莫西林克林維酸鉀片 (0.21g/kg)效果相當，組間比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。結果見表 3。

表3 通瘀去炎湯對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s)

表3 通瘀去炎湯對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05

組別 劑量(g/kg)動物數(shù)(只)腫脹率(%)空白對照組- 10 95.69 ±36.54阿莫西林克林維酸鉀片組 0.21 10 54.64 ±22.41*通瘀去炎湯高劑量組 16 10 47.43 ±31.04*通瘀去炎湯中劑量組 8 10 53.24 ±29.42*通瘀去炎湯低劑量組 4 10 56.33 ±28.14*

2.3 止血實驗 實驗結果表明，與空白對照組比較，通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能加速小鼠凝血的時間，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05或P＜0.01)。通瘀去炎組高、中、低劑量 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)效果相當，組間比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。結果見表4。

表4 通瘀去炎湯對小鼠凝血時間的影響 (±s)

表4 通瘀去炎湯對小鼠凝血時間的影響 (±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量 (g/kg)動物數(shù) (只)凝血時間 (min)空白對照組-10 1.96 ±0.43云南白藥膠囊組 0.26 10 1.36 ±0.31＊＊通瘀去炎湯高劑量組 16 10 1.20 ±0.40＊＊通瘀去炎湯中劑量組 8 10 1.50 ±0.35*通瘀去炎湯低劑量組 4 10 1.52 ±0.30*

2.4 化瘀實驗 結果表明，與空白對照組比較，通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能顯著提升小鼠巨噬細胞吞噬能力，增加吞噬率與吞噬指數(shù)，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)。其中通瘀去炎湯高、中劑量 (16 g/kg、8g/kg)的作用強于云南白藥膠囊 (0.26g/kg)，組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);通瘀去炎湯低劑量 (4g/kg)與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)的效果相當，組間比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。結果見表5。

表5 通瘀去炎湯對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響 (±s)

表5 通瘀去炎湯對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響 (±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;與云南白藥膠囊組比較，*P＜0.05

組別 劑量(g/kg)動物數(shù)(只) 吞噬率 (%)吞噬指數(shù)空白對照組- 10 45.87 ±3.29 2.46 ±0.15云南白藥膠囊組 0.26 10 59.17 ±3.41＊＊ 2.92 ±0.18＊＊通瘀去炎湯高劑量組 16 10 68.97 ±3.49＊＊ 4.07 ±0.31＊＊△通瘀去炎湯中劑量組 8 10 62.05 ±3.00＊＊ 3.58 ±0.10＊＊△通瘀去炎湯低劑量組 4 10 57.44 ±2.12＊＊ 2.76 ±0.21＊＊

3 討論

黎族杞方言地區(qū)通瘀去炎湯主要由四味藥材組成，其中一味為海南草珊瑚，其他三種皆為產(chǎn)在海南熱帶雨林地區(qū)較為常見的草藥［5］。本文對通瘀去炎湯進行了急性毒性實驗和抗炎、止血、化瘀的藥效學研究。結果表明，通瘀去炎湯的最大給藥量為160g/kg，相當于臨床人日用生藥量(即生藥0.5g/kg體重)的320倍，安全閾值較高。同時，通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹 (P＜0.05)、能加速小鼠凝血的時間 (P＜0.05)、顯著提升小鼠巨噬細胞吞噬能力，增加吞噬率與吞噬指數(shù) (P＜0.05)。其抗炎作用與與阿莫西林克林維酸鉀片 (0.21g/kg)效果相當，止血作用與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)相當，而在化瘀作用上，通瘀去炎湯高、中劑量 (16 g/kg、8g/kg)明顯強于云南白藥膠囊 (0.26g/kg)，通瘀去炎湯低劑量 (4g/kg)與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)的效果相當。研究結果提示，本處方具有較好的抗炎止血作用，特別在清除由血管損傷，紅細胞外溢所引起的淤青和腫脹方面強于云南白藥。而對于本處方藥效實驗的深入研究、長期毒性實驗及機制研究等將在接下來的工作中進行進一步的探討。

［1］《黎族簡史》編寫組.黎族簡史［M］.廣州:廣東人民出版社，1980.

［2］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:656-658.

［3］徐叔云.藥理實驗方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991.

［4］鄭才成.海南黎藥發(fā)展研究概況［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2007，13(5):2-3.

［5］鄭希龍，陳紅鋒，李榕濤，等.海南潤方言黎族藥用民族植物學研究［J］.云南植物研究，2008，30(2):195-210.

［6］關亞麗，潘琴，黃敏仁.民族植物學與海南黎藥資源開發(fā)［J］.南京林業(yè)大學學報 (自然科學版)，2009，33(4):145-149.