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        黎族通瘀去炎湯的藥效學(xué)初步和急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

        2014-10-16 10:39:36張一云侯世封楊麗娜
        中國(guó)民族民間醫(yī)藥 2014年17期
        關(guān)鍵詞:湯高云南白藥藥量

        張一云 唐 菲 高 雨 侯世封* 楊麗娜

        1.海南省藥物研究所,海南 海口 571100;2.海南黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會(huì),海南 ???572200

        黎族民間醫(yī)藥作為中國(guó)傳統(tǒng)民族用藥的一種,用藥歷史具有3000多年[1],但由于信息溝通方面的問(wèn)題,一直未能得到有效的傳承和發(fā)展[4]。本課題研究的是黎族杞方言地區(qū) (五指山)藥王使用的通瘀去炎湯,由黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會(huì)楊麗娜女士提供,該方由4味藥組成,原植物皆產(chǎn)在海拔100~500米的丘陵和山地,在當(dāng)?shù)刂髦胃黝惣毙匝装Y及內(nèi)外出血。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該方,對(duì)處方進(jìn)行了急性毒性研究和藥效學(xué)的初步研究,為該方的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

        1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM小鼠,體重18~20g,雌雄各半,由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(湘)2009-0012,SPF動(dòng)物房飼養(yǎng)。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 通瘀去炎湯由4味藥組成,取通瘀去炎湯處方藥材粉碎,用8倍量的水提取半小時(shí),濾過(guò),余下的藥渣用6倍量的水繼續(xù)提取半小時(shí),合并濾液,濃縮至2g/ml(每ml含生藥材2g),備用;云南白藥膠囊,0.25g/粒,國(guó)藥準(zhǔn)字Z53020799,由云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):ZBA1305;阿莫西林克林維酸鉀片:片劑,0.375g/片,國(guó)藥準(zhǔn)字 H20043183,由石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn),批號(hào):160130108。

        1.1.3 試劑及儀器 二甲苯、50ul移液槍、生物通風(fēng)安全柜、離心機(jī)、顯微鏡、灌胃針、干凈載玻片、剪刀、鑷子、1ml注射針、生理鹽水、瑞氏染液、1%雞紅細(xì)胞。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 急性毒性試驗(yàn)[2-3]經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn),按最大體積 (40ml/kg),最大濃度 (2g/ml)灌胃給藥小鼠,未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡,遂進(jìn)行最大給藥量實(shí)驗(yàn)。取18~20gKM種小鼠40只,雌雄各半,隨機(jī)分成兩組,即正常對(duì)照組和通瘀去炎湯組,每組20只,于實(shí)驗(yàn)前禁食1晚,通瘀去炎湯組按40ml/kg體重,2g/ml藥物濃度,一天內(nèi)灌服2次,正常對(duì)照組灌服等量容積的蒸餾水,給藥后連續(xù)觀察14d小鼠的活動(dòng)、體重及飲食狀況,并詳細(xì)記錄,計(jì)算最大給藥量。選擇最大給藥量的1/10、1/20、1/40分別作為藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)藥物的高、中、低劑量組。

        1.2.2 抗急性炎癥實(shí)驗(yàn)[2-3]取健康昆明種小鼠,18~20g,雌雄各半,隨機(jī)分為5組,每組10只動(dòng)物,即空白對(duì)照組 (給以相應(yīng)容積的蒸餾水)、阿莫西林克林維酸鉀片組 (0.21g/kg)、通瘀去炎湯高劑量組 (16g/kg)、中劑量組 (8g/kg)、低劑量組 (4g/kg),小鼠按0.2ml/10g/d灌胃給藥1次,連續(xù)給藥4d,末次給藥30min后,以移液槍在小鼠右耳涂以二甲苯0.05ml/只,左耳作為對(duì)照不進(jìn)行任何處理,15min后處死動(dòng)物,用直徑8mm的打孔器將左右雙耳同部位等面積切下,以萬(wàn)分之一天平精密稱量,按以下公式計(jì)算并比較腫脹值、腫脹率及抑制率,,以此評(píng)價(jià)藥物的抗炎作用:腫脹值=右耳片重量-左耳片重量;腫脹率 (%)=(腫脹值/左耳重量) ×100%;抑制率 (%)=(給藥組平均腫脹率-對(duì)照組平均腫脹率)/對(duì)照組平均腫脹率×100%。

        1.2.3 止血實(shí)驗(yàn)[2-3]取健康昆明種小鼠,18~20g,雌雄各半,隨機(jī)分為5組,每組10只動(dòng)物,即空白對(duì)照組(給以相應(yīng)容積的蒸餾水)、云南白藥組 (0.26g/kg)、通瘀去炎湯高劑量組 (16g/kg)、中劑量組 (8g/kg)、低劑量組(4g/kg),各組小鼠按0.2ml/10g/d灌胃給藥1次,連續(xù)給藥4d,末次給藥30min后,用毛細(xì)管從小鼠球后靜脈叢取血于載玻片,血滴直徑約為5mm,立即用秒表計(jì)時(shí)。每隔10s(second)用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕挑動(dòng)一次,并觀察有無(wú)血絲挑起。從采血開(kāi)始至挑起血絲止為凝血時(shí)間,比較各組凝血時(shí)間的差異。

        1.2.4 化瘀實(shí)驗(yàn)[2-3]取健康昆明種小鼠,18~20g,雌雄各半,隨機(jī)分為5組,每組10只動(dòng)物,即空白對(duì)照組(給以相應(yīng)容積的蒸餾水)、云南白藥組 (0.26g/kg)、通瘀去炎湯高劑量組 (16g/kg)、中劑量組 (8g/kg)、低劑量組 (4g/kg),各組小鼠按0.2ml/10g/d灌胃給藥1次,連續(xù)給藥5d。給藥第2天開(kāi)始腹腔注射6%淀粉溶液1ml,連續(xù)3d。末次給藥后,小鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液2ml,輕揉腹部使之分散。30min后脫椎處死小鼠,腹腔注射生理鹽水2ml,剪開(kāi)腹部用吸管吸取腹腔液,滴加一滴于干凈載玻片上,再滴加一滴生理鹽水稀釋。10min后棄去生理鹽水,待標(biāo)本稍微干燥,在其上滴加3~4滴瑞氏染液染色5min,甩去染液,蒸餾水溫柔沖洗,晾干后置于顯微鏡下觀察。觀察并統(tǒng)計(jì)40X鏡下5個(gè)視野內(nèi)的巨噬細(xì)胞的總數(shù)、吞噬了紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)及每個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬的紅細(xì)胞數(shù)。按照如下公式計(jì)算并比較吞噬率及吞噬指數(shù)。吞噬率=(吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞/總計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞)×100%;吞噬指數(shù)=總吞噬的紅細(xì)胞數(shù)/吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)。

        2 結(jié)果

        2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) (最大給藥量試驗(yàn))在無(wú)法測(cè)出小鼠LD50情況下,進(jìn)行了最大給藥量實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中觀察到正常對(duì)照組和通瘀去炎湯組小鼠均于給藥后10min內(nèi)活動(dòng)稍有緩慢,30min恢復(fù)正常,給藥14天內(nèi),動(dòng)物均無(wú)死亡,活動(dòng)及飲食皆正常,眼、鼻、口無(wú)粘液性分泌物。對(duì)體重和進(jìn)食量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。計(jì)算最大給藥量為 160g/kg,相當(dāng)于臨床人日用生藥量 (即生藥0.5g/kg體重)的320倍。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

        表1 通瘀去炎湯最大給藥量對(duì)小鼠體重的影響 (±s)

        表1 通瘀去炎湯最大給藥量對(duì)小鼠體重的影響 (±s)

        組別 劑量g/kg動(dòng)物數(shù)(只)給藥前體重(g)給藥后體重 (g)第7d 第14d正常對(duì)照組- 20 19.78 ±1.23 24.88 ±1.56 31.99 ±2.75通瘀去炎湯組160 20 19.55 ±1.43 25.25 ±1.98 32.48 ±2.76

        表2 通瘀去炎湯最大給藥量對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響 (±s)

        表2 通瘀去炎湯最大給藥量對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響 (±s)

        組別 劑量g/kg動(dòng)物數(shù)(只)給藥前日進(jìn)食(g)給藥后日進(jìn)食量 (g)第7d 第14d正常對(duì)照組- 20 7.67 ±1.76 9.13 ± 2.88 11.11 ± 2.54通瘀去炎湯組160 20 7.58 ±2.13 9.65 ± 2.34 11.43 ± 2.79

        2.2 抗急性炎癥實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05);通瘀去炎組高、中、低劑量 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)與阿莫西林克林維酸鉀片 (0.21g/kg)效果相當(dāng),組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表 3。

        表3 通瘀去炎湯對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s)

        表3 通瘀去炎湯對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s)

        注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05

        組別 劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)(只)腫脹率(%)空白對(duì)照組- 10 95.69 ±36.54阿莫西林克林維酸鉀片組 0.21 10 54.64 ±22.41*通瘀去炎湯高劑量組 16 10 47.43 ±31.04*通瘀去炎湯中劑量組 8 10 53.24 ±29.42*通瘀去炎湯低劑量組 4 10 56.33 ±28.14*

        2.3 止血實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能加速小鼠凝血的時(shí)間,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05或P<0.01)。通瘀去炎組高、中、低劑量 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)效果相當(dāng),組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 通瘀去炎湯對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 (±s)

        表4 通瘀去炎湯對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 (±s)

        注:與空白對(duì)照組比較,*P <0.05,**P <0.01

        組別 劑量 (g/kg)動(dòng)物數(shù) (只)凝血時(shí)間 (min)空白對(duì)照組-10 1.96 ±0.43云南白藥膠囊組 0.26 10 1.36 ±0.31**通瘀去炎湯高劑量組 16 10 1.20 ±0.40**通瘀去炎湯中劑量組 8 10 1.50 ±0.35*通瘀去炎湯低劑量組 4 10 1.52 ±0.30*

        2.4 化瘀實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能顯著提升小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力,增加吞噬率與吞噬指數(shù),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。其中通瘀去炎湯高、中劑量 (16 g/kg、8g/kg)的作用強(qiáng)于云南白藥膠囊 (0.26g/kg),組間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05);通瘀去炎湯低劑量 (4g/kg)與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)的效果相當(dāng),組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表5。

        表5 通瘀去炎湯對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 (±s)

        表5 通瘀去炎湯對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 (±s)

        注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05,**P <0.01;與云南白藥膠囊組比較,*P<0.05

        組別 劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)(只) 吞噬率 (%)吞噬指數(shù)空白對(duì)照組- 10 45.87 ±3.29 2.46 ±0.15云南白藥膠囊組 0.26 10 59.17 ±3.41** 2.92 ±0.18**通瘀去炎湯高劑量組 16 10 68.97 ±3.49** 4.07 ±0.31**△通瘀去炎湯中劑量組 8 10 62.05 ±3.00** 3.58 ±0.10**△通瘀去炎湯低劑量組 4 10 57.44 ±2.12** 2.76 ±0.21**

        3 討論

        黎族杞方言地區(qū)通瘀去炎湯主要由四味藥材組成,其中一味為海南草珊瑚,其他三種皆為產(chǎn)在海南熱帶雨林地區(qū)較為常見(jiàn)的草藥[5]。本文對(duì)通瘀去炎湯進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)和抗炎、止血、化瘀的藥效學(xué)研究。結(jié)果表明,通瘀去炎湯的最大給藥量為160g/kg,相當(dāng)于臨床人日用生藥量(即生藥0.5g/kg體重)的320倍,安全閾值較高。同時(shí),通瘀去炎湯高、中、低劑量組 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹 (P<0.05)、能加速小鼠凝血的時(shí)間 (P<0.05)、顯著提升小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力,增加吞噬率與吞噬指數(shù) (P<0.05)。其抗炎作用與與阿莫西林克林維酸鉀片 (0.21g/kg)效果相當(dāng),止血作用與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)相當(dāng),而在化瘀作用上,通瘀去炎湯高、中劑量 (16 g/kg、8g/kg)明顯強(qiáng)于云南白藥膠囊 (0.26g/kg),通瘀去炎湯低劑量 (4g/kg)與云南白藥膠囊 (0.26g/kg)的效果相當(dāng)。研究結(jié)果提示,本處方具有較好的抗炎止血作用,特別在清除由血管損傷,紅細(xì)胞外溢所引起的淤青和腫脹方面強(qiáng)于云南白藥。而對(duì)于本處方藥效實(shí)驗(yàn)的深入研究、長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究等將在接下來(lái)的工作中進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

        [1]《黎族簡(jiǎn)史》編寫(xiě)組.黎族簡(jiǎn)史[M].廣州:廣東人民出版社,1980.

        [2]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:656-658.

        [3]徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1991.

        [4]鄭才成.海南黎藥發(fā)展研究概況[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志,2007,13(5):2-3.

        [5]鄭希龍,陳紅鋒,李榕濤,等.海南潤(rùn)方言黎族藥用民族植物學(xué)研究[J].云南植物研究,2008,30(2):195-210.

        [6]關(guān)亞麗,潘琴,黃敏仁.民族植物學(xué)與海南黎藥資源開(kāi)發(fā)[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版),2009,33(4):145-149.

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