張鳳銀，陳禪友，張 萍，譚友波，李俊芳

(江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國武漢 430056)

長豇豆 (Vigna unguiculata W.ssp.sesquipedalis(L.)Verd.，2n=22)具有適應(yīng)性廣，耐熱性能強(qiáng)等特性.我國南北各地均有分布，尤以南方栽培普遍，全國栽培面積達(dá)40多萬hm2，是解決夏秋淡季蔬菜供應(yīng)的主要蔬菜作物之一.然而其種植季節(jié)正值夏季高溫時(shí)期，常常受到干旱的脅迫，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)［1-2］.

長豇豆受到干旱脅迫后，會(huì)引起一系列生理生化的變化.汪寶根等［1］研究發(fā)現(xiàn)，長豇豆受到干旱脅迫后，其生長量和凈光合效率降低，而葉片質(zhì)膜的透性增加.康利平等［3］研究發(fā)現(xiàn)，隨干旱脅迫時(shí)間的延長，長豇豆葉片含水量、葉綠素含量、氣孔張開率、氣孔導(dǎo)度、光合速率以及蒸騰速率均降低.代其林等［4］利用5%PEG溶液模擬干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)長豇豆幼苗抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性隨脅迫時(shí)間的延長均出現(xiàn)先升后降的變化規(guī)律.前人主要報(bào)道了長豇豆多項(xiàng)生理指標(biāo)在同一干旱脅迫程度下，隨時(shí)間變化的規(guī)律，但至今少見有不同干旱脅迫程度對(duì)長豇豆生理指標(biāo)影響的報(bào)道.為此，在本研究中，利用不同質(zhì)量濃度PEG溶液模擬不同程度干旱脅迫，研究長豇豆種子萌發(fā)指標(biāo)、萌發(fā)幼苗的生長指標(biāo)及抗氧化酶活性與干旱脅迫程度之間的關(guān)系，以期為今后開展長豇豆耐旱機(jī)理的研究提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

以長豇豆品種鄂豇豆2號(hào)的種子為試驗(yàn)材料，由湖北省豆類(蔬菜)植物工程技術(shù)研究中心提供.PEG選用PEG-6000，為日本純品，購自天津市化學(xué)試劑批發(fā)部.

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn) 選擇籽粒飽滿、大小均勻一致、完好無損的長豇豆種子.采用溫湯浸種法浸種2 h，撈出，晾干，然后將種子擺放在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別加入15 mL不同質(zhì)量濃度的PEG處理液.PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)為0、50、100、150、200、250、300 g/L 等 7 個(gè)梯度，相對(duì)應(yīng)的滲透勢(shì)［5］分別為 0 MPa、－0.45 MPa、－1.38 MPa、－2.78 MPa、－4.64 MPa、－6.99 MPa、－9.80 MPa.種子在溫度為28 ±1 ℃、RH 為85%的PYX2DHS型恒溫培養(yǎng)箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)中培養(yǎng).每個(gè)培養(yǎng)皿30粒種子，每個(gè)處理重復(fù)3次.每2 d更換濾紙，并添加15 mL原液，使各處理PEG滲透脅迫的質(zhì)量濃度保持相對(duì)穩(wěn)定.連續(xù)培養(yǎng)8 d結(jié)束長豇豆種子萌發(fā)試驗(yàn).

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 從長豇豆種子培養(yǎng)次日起每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù).種子萌發(fā)指標(biāo)的計(jì)算公式如下:

發(fā)芽勢(shì)(%)=發(fā)芽初期(前5 d)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100;

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽終期(前8 d)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100;

發(fā)芽指數(shù) =∑(Gt/Dt)，式中Gt為t天的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù).

種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)處理的每個(gè)重復(fù)中分別隨機(jī)取10株幼苗，測(cè)量其芽長、根長，并統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù).豇豆幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量分別用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法［6］、愈創(chuàng)木酚法［6］及用硫代巴比妥酸(TBA)比色法［6］測(cè)定.

1.2.3 數(shù)據(jù)資料的整理及分析 用Excel2003處理數(shù)據(jù)，用DPS2000軟件進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG脅迫對(duì)長豇豆種子萌發(fā)及萌發(fā)期幼苗生長的影響

2.1.1 PEG脅迫對(duì)長豇豆種子萌發(fā)的影響 表1為不同程度PEG脅迫對(duì)長豇豆種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的影響.由表1可知，與對(duì)照相比，PEG質(zhì)量濃度≤150 g/L，對(duì)長豇豆種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)的影響不顯著，而PEG質(zhì)量濃度≥200 g/L時(shí)，長豇豆種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著降低.其中，200 g/L PEG和250 g/L PEG處理和對(duì)照相比，發(fā)芽勢(shì)分別下降了25.53%和88.03%，發(fā)芽率分別下降了21.34%和74.67%，發(fā)芽指數(shù)分別下降了37.96%和88.26%.長豇豆種子在300 g/L PEG脅迫下完全不能萌發(fā).由此可見，低質(zhì)量濃度PEG對(duì)長豇豆種子萌發(fā)影響不大，但高質(zhì)量濃度PEG延緩長豇豆種子萌發(fā)，降低種子活力，而且PEG質(zhì)量濃度越高，抑制程度越嚴(yán)重.

表1 PEG脅迫對(duì)長豇豆種子萌發(fā)的影響Tab.1 Effects of PEG stress on seed germination of cowpea

2.1.2 PEG脅迫對(duì)長豇豆萌發(fā)期幼苗生長的影響 表2為不同質(zhì)量濃度PEG脅迫對(duì)長豇豆萌發(fā)期幼苗生長的影響.從表2可知，隨PEG質(zhì)量濃度的增加，長豇豆幼苗的主根長、芽長以及側(cè)根數(shù)均呈逐漸下降的趨勢(shì).與對(duì)照相比，50、100 g/L PEG處理的長豇豆幼苗的主根長差異不顯著，而150、200 g/L PEG處理的長豇豆主根長顯著短于對(duì)照，分別為對(duì)照的82.74%和55.36%;50 g/L PEG處理的長豇豆幼苗芽長與對(duì)照差異不顯著，但當(dāng)PEG質(zhì)量濃度≥100 g/L，各處理的長豇豆幼苗芽長顯著短于對(duì)照，其中，100、150、200 g/L PEG處理的長豇豆幼苗芽長分別是對(duì)照的77.19%、40.87%和17.30%;50 g/L PEG處理的長豇豆幼苗的側(cè)根數(shù)也與對(duì)照差異不顯著，而當(dāng)PEG質(zhì)量濃度≥100 g/L時(shí)，各處理幼苗的側(cè)根數(shù)顯著少于對(duì)照，其中100、150、200 g/L PEG處理的長豇豆幼苗的側(cè)根數(shù)分別為對(duì)照的80.55%，73.61%和14.58%.長豇豆根長與芽長的比值也隨PEG質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢(shì)，而且當(dāng)PEG質(zhì)量濃度≥150 g/L，各處理的根長/芽長的比值與對(duì)照差異顯著，而PEG質(zhì)量濃度≤150 g/L時(shí)，各處理根長/芽長的比值與對(duì)照差異不顯著.由此可見，PEG抑制了長豇豆萌發(fā)期幼苗的生長，且質(zhì)量濃度越高，幼苗生長受抑制越嚴(yán)重;長豇豆幼苗芽生長和側(cè)根形成比主根生長對(duì)PEG脅迫更為敏感(因長豇豆幼苗芽生長和側(cè)根形成顯著受抑制的PEG質(zhì)量濃度低于主根生長的，另外，隨PEG質(zhì)量濃度增加，長豇豆幼苗的根長/芽長比值也隨著增加).

表2 PEG脅迫對(duì)長豇豆幼苗生長的影響Tab.2 Effects of PEG stress on seedling growth of cowpea

2.2 PEG脅迫對(duì)長豇豆萌發(fā)期幼苗SOD和POD活性及MDA含量的影響

2.2.1 PEG脅迫對(duì)長豇豆萌發(fā)期幼苗的SOD和POD活性影響 由表3可知，長豇豆萌發(fā)期幼苗的SOD和POD活性隨PEG質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì).其中，50、250 g/L PEG處理的長豇豆幼苗的SOD活性與對(duì)照之間差異不顯著，而100、150、200 g/L PEG處理的長豇豆幼苗SOD活性顯著高于對(duì)照，分別較對(duì)照高54.7%、144.4%和47.3%;50 g/L PEG處理的長豇豆幼苗POD活性與對(duì)照差異不顯著，100、150、200 g/L PEG處理的幼苗POD活性顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照增加34.1%、89.3%和17.5%，而250 g/L PEG處理的幼苗POD活性顯著低于對(duì)照，只有對(duì)照幼苗POD活性的54.8%.

2.2.2 PEG脅迫對(duì)長豇豆萌發(fā)期幼苗的MDA含量影響 MDA含量反映植物細(xì)胞膜的受傷害程度，兩者成正比例關(guān)系.由表3可見，隨PEG質(zhì)量濃度的增大，長豇豆幼苗MDA含量呈逐漸上升的趨勢(shì).其中，50 g/L PEG處理的幼苗MDA含量與對(duì)照無顯著的差異;而PEG質(zhì)量濃度≥100 g/L的處理的幼苗MDA含量顯著高于對(duì)照，其中，100、150、200、250 g/L PEG 處理的幼苗 MDA 含量分別比對(duì)照增加了113.1%、211.4%、314.1%和464.3%.這表明，隨PEG質(zhì)量濃度增加，長豇豆萌發(fā)期幼苗的細(xì)胞膜受傷害程度加重.

表3 PEG脅迫對(duì)長豇豆幼苗SOD、POD活性和MDA含量的影響Tab.3 Effects of PEG stress on the activity of SOD and POD and content of MDA of cowpea

3 討論與結(jié)論

植物種子發(fā)芽指標(biāo)是反映種子活力大小的最可靠指標(biāo)，也是反映種子萌發(fā)耐逆性能的最直接指標(biāo)［7］.本研究結(jié)果表明，長豇豆種子能在PEG質(zhì)量濃度≤150 g/L的干旱脅迫下正常萌發(fā)，而在PEG質(zhì)量濃度≥200 g/L干旱脅迫下，種子萌發(fā)受到明顯的抑制，且隨PEG質(zhì)量濃度的增加，種子萌發(fā)受抑制程度加重.據(jù)報(bào)道，野菊［8］、不結(jié)球白菜［9］以及綿棗兒［10］種子均在250 g/L PEG脅迫下完全不能萌發(fā)，而長豇豆種子在300 g/L PEG脅迫下不能萌發(fā)，但在250 g/L PEG脅迫下仍有11.11%的萌發(fā)率，這表明不同植物種子萌發(fā)耐受極限干旱脅迫的能力不同.本研究結(jié)果同楊柳等［11］及吳麗云等［12］分別在黃麻和八棱海棠中的研究結(jié)果相似，即整個(gè)種子萌發(fā)期間用PEG脅迫，表現(xiàn)出隨PEG脅迫強(qiáng)度的增加，種子萌發(fā)受抑制程度加大.而李京春等［13］發(fā)現(xiàn)，用200 g/L PEG處理天人菊種子4 h能提高其發(fā)芽率;袁媛等［14］也發(fā)現(xiàn)，黃芩種子用200 g/L PEG浸種1 h或100 g/L PEG浸種4 h也能提高其發(fā)芽率.陳禪友等［15］發(fā)現(xiàn)，在15℃低溫下，用250 g/L PEG預(yù)處理低活力長豇豆種子1～2 d，或高活力長豇豆種子3～4 d，能提高其活力.這表明，PEG脅迫對(duì)種子活力和萌發(fā)效應(yīng)的影響可因植物種類、PEG質(zhì)量濃度、脅迫時(shí)間以及處理時(shí)溫度等而異.

根系是植物吸收水分的主要器官，也是在水分脅迫下最先起反應(yīng)的部位［16］.根長、根重及下層根的數(shù)量與植物的抗旱性呈極顯著的正相關(guān)［17］.本研究發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度的PEG對(duì)長豇豆萌發(fā)期幼苗主根生長和側(cè)根的形成影響不顯著，而高質(zhì)量濃度PEG抑制根系的生長，且PEG質(zhì)量濃度越高，對(duì)長豇豆萌發(fā)幼苗根系生長的抑制越大，這與李文鶴等［8］對(duì)野菊的研究結(jié)果一致.而Gullo等［18］報(bào)道，在水分脅迫下，禾谷類植物通過各級(jí)側(cè)根的加速分生和分枝而進(jìn)行補(bǔ)償生長，提高根表面積和體積，從而提高吸收能力.華智銳等［19］及宋麗華等［20］也發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度的PEG促進(jìn)商洛黃芩和臭椿根生長，而高質(zhì)量濃度PEG抑制根的生長.本試驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度PEG對(duì)長豇豆根生長的促進(jìn)作用，也許是長豇豆對(duì)低質(zhì)量濃度PEG的干旱脅迫的促進(jìn)作用不敏感或者是PEG所設(shè)質(zhì)量濃度梯度過大未能表現(xiàn)出促進(jìn)作用，還有待進(jìn)一步研究.

干旱脅迫引起植物代謝紊亂，產(chǎn)生大量的活性氧，使膜脂過氧化，破壞膜系統(tǒng)［21］.而植物為避免活性氧的危害，將主動(dòng)調(diào)動(dòng)抗氧化酶類(SOD、POD及CAT等)活性或增加生成量來消除活性氧，控制脂質(zhì)氧化，減少膜系統(tǒng)的傷害，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的危害.抗氧化酶表達(dá)量的多少與活性都直接決定植物的抗逆性能的強(qiáng)弱［22］.本研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下，隨PEG質(zhì)量濃度增加，長豇豆幼苗的SOD和POD活性均呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，這與李曉東等［23］、姜慧芳等［24］以及左利萍等［25］的研究結(jié)果一致.說明在低質(zhì)量濃度PEG的誘導(dǎo)下，長豇豆通過提高保護(hù)酶的活性增強(qiáng)植物的抗氧化能力，而在高質(zhì)量濃度PEG脅迫下，隨著活性氧的增加，超過抗氧化酶系統(tǒng)所能清除能力，反過來活性氧對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)又造成傷害，從而引起其活性降低［24］.

在正常生理?xiàng)l件下，植物在代謝過程中產(chǎn)生超氧化物自由基等活性氧及其消除存在一個(gè)平衡，因而植物不會(huì)累積活性氧，而在逆境和脅迫條件下植物會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，若不能及時(shí)消除，則會(huì)引起細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過氧化而受到傷害［21］.MDA含量是反映細(xì)胞受脅迫程度大小的指標(biāo)［26］.本研究結(jié)果顯示，隨PEG質(zhì)量濃度的增加，長豇豆萌發(fā)期幼苗MDA含量呈逐漸增加趨勢(shì)，說明細(xì)胞膜受傷害程度增加，這與李曉東等［23］在玉帶草中的研究結(jié)果相似.

總之，隨PEG脅迫程度的增加，長豇豆種子萌發(fā)及幼苗的生長受抑制逐漸加重，幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度亦逐漸加大.

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