黃曉平1,2，王曉1,2，楊春雪1,2，賈東方1,2，林俊生1,2，刁勇1,2

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長效人促卵泡激素CHO細胞株的構(gòu)建及其體內(nèi)活性

黃曉平，王曉，楊春雪，賈東方，林俊生，刁勇

1 華僑大學分子藥物研究院，福建泉州 362021 2 華僑大學生物醫(yī)學學院，福建泉州 362021

黃曉平, 王曉, 楊春雪, 等. 長效人促卵泡激素CHO細胞株的構(gòu)建及其體內(nèi)活性. 生物工程學報, 2014, 30(6): 954?961.Huang XP, Wang X, Yang CX, et al.Expression of human long-acting FSH in CHO cell and its bioactivity in vivo. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 954?961.

促卵泡激素 (FSH) 是具有促進卵泡與睪丸發(fā)育作用的一種垂體糖蛋白激素。因其體內(nèi)半衰期較短，臨床上需要連續(xù)10 d以上每天注射，病人使用非常不方便。本文旨在通過提高糖基化程度，研制一種長效FSH。通過一段含有兩個N-糖基化位點的連接序列, 將人FSH α鏈與β鏈cDNA融合，并插入pcDNA3.1(+)表達載體。表達載體轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞后，通過G418篩選得到陽性單克隆細胞，并經(jīng)PCR和Western blotting證實。該重組FSH為單鏈蛋白，分子量約為49 kDa。經(jīng)無血清培養(yǎng)，工程細胞株培養(yǎng)上清液中重組FSH的表達量可達3 mg/L。單次注射該重組FSH能夠促進大鼠卵巢發(fā)育與卵泡成熟，且藥效與連續(xù)8次注射Folltropin-V的相近。實驗結(jié)果顯示，本研究已成功獲得一種長效重組FSH。

促卵泡激素，CHO-K1細胞，長效，無血清培養(yǎng)

促卵泡激素 (FSH) 是由α和β兩個亞基組成的一種糖蛋白，兩個亞基通過非共價結(jié)合形成二聚體。FSH的α-亞基與其他糖蛋白激素，如絨毛膜促性腺激素(CG)、黃體素(LH) 和促甲狀腺激素(TSH) 的α-亞基完全相同，而各糖蛋白激素的β-亞基則在結(jié)構(gòu)上稍有差異, 從而賦予每種激素不同的生物功能。研究表明FSH的α亞基羧基端與其受體結(jié)合緊密，因此進行融合表達時都采用β亞基在后，α亞基在前提供游離的α亞羧基的連接方式。

目前市售的FSH制劑大部分是從尿液或者動物垂體中提取而來，但這些產(chǎn)品仍存在一定的局限性，例如半衰期短、產(chǎn)品純度低、活性差，或因含有他激素和潛在的傳染性病原而影響藥物的療效，已經(jīng)不能滿足如今市場的需求，而采用基因工程的方法可以獲得純度高、活性優(yōu)的重組FSH。

中國倉鼠卵巢細胞 (CHO) 是廣泛用于生產(chǎn)復雜蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)，能對復雜糖蛋白進行很好地折疊、組裝和翻譯后修飾，在分子結(jié)構(gòu)和生物學功能等方面更接近天然蛋白。目前已經(jīng)上市的重組糖蛋白類藥物基本上由CHO細胞表達系統(tǒng)獲得。FSH β鏈中含有N7和 N24兩個N-連接糖基化位點，而α鏈也含有兩個糖基化位點，故本課題選擇CHO表達系統(tǒng)。

FSH是正常婦女卵泡生長、成熟和男子精子生成所必不可少的一種糖蛋白。在當前輔助生殖周期的10–12 d中，普通FSH的制劑需要每天皮下注射1次或者2次，這種反復注射給患者帶來了諸多不便。目前已有諸多方法來延長蛋白藥物的半衰期，如化學修飾法、單鏈融合CTP、增加 N-連接糖基化等。Klein等研究表明，重組FSH在體內(nèi)的半衰期為3.7 h，而增加2個N-糖基化位點的重組長效FSH在體內(nèi)的半衰期為7.3 h，是普通FSH半衰期的2倍。

本課題采用含有2個N-連糖基化的連接序列，將FSH α鏈與β鏈融合成單鏈。α鏈位于融合蛋白的羧基端，提供游離的羧基，有利于重組FSH與其受體更為緊密的結(jié)合，β鏈位于融合蛋白的氨基端。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-K1細胞、G418篩選得到單克隆，進行無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)上清進行Western blotting分析和大鼠體內(nèi)活性分析，為長效FSH制劑的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DH5α、pcDNA3.1 (+) 由本實驗室保存。CHO-K1細胞株購自ATCC細胞庫。T4 DNA 連接酶、dⅢ、RⅠ、1406Ⅰ等限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自碧云天公司。胎牛血清 (FBS) 購自Hyclone公司。F-12K營養(yǎng)混合培養(yǎng)基購自Thermo scientific公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。G418購自Amersco公司。Folltropin-V (Belleville, Canada)，兔抗人FSH一抗，山羊抗兔二抗均購自Abcam公司。ELISA購自Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 表達載體pcDNA3.1(+)-FSH的構(gòu)建

按照文獻[22]中的方法，使用N-連接糖基化的連接序列(氨基酸序列GSGSNATGSG SNATSGSTS)，融合人FSH α鏈與β鏈。全基因序列由南京金斯瑞公司合成，目的基因經(jīng)d Ⅲ與RⅠ酶切、回收，目的基因克隆至pcDNA3.1(+)載體的d Ⅲ/RⅠ位點之間，轉(zhuǎn)化至DH5α中，挑取單克隆進行PCR鑒定與質(zhì)粒酶切鑒定。

1.2.2 CHO-K1細胞的轉(zhuǎn)染

CHO-K1細胞用含10% FBS的F-12K營養(yǎng)混合培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO濃度為5%。待細胞匯合度至85%時，胰蛋白酶消化細胞，制備成懸液，接種至24孔板中。待細胞匯合度至80%時進行轉(zhuǎn)染，2 μL Lipofectamine 2000與0.8 μg經(jīng)過1406Ⅰ線性化的pcDNA3.1(+)-FSH質(zhì)?；旌虾?，均勻加至含10% FBS的F-12K營養(yǎng)混合培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h，胰蛋白酶消化制備細胞懸液，按照1∶10比例進行繼續(xù)培養(yǎng)，加入終濃度為800 μg/mL G418進行篩選，每3 d換一次液，直至多克隆細胞形成。

1.2.3 穩(wěn)定表達FSH細胞系的篩選與鑒定

將多克隆細胞制備成細胞懸液，倍比稀釋的方法篩選單克隆細胞，取單克隆細胞培養(yǎng)上清進行ELISA檢測，將表達量較大的單克隆細胞進行多次單克隆篩選得到穩(wěn)定表達FSH的細胞系，并命名為CHO-FSH。培養(yǎng)上清進行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)印至PVDF上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，兔抗人FSH一抗室溫孵育2 h，PBST (PBS+0.1%Twen-20) 漂洗3 次，羊抗兔二抗室溫孵育2 h，漂洗3次，ECL顯色成像。

分別以篩選得到的4株單克隆細胞系基因組和CHO-K1細胞的基因組為模板，以Forward (5′-TTAAGCTTATGAAGACACTCC AGTTTTTCTTCC-3′) 和Reverse (5′-TTGAATTC TTAAGATTTGTGATAATAACAAGTA-3′)為引物，進行PCR擴增。PCR條件為：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定FSH基因是否已整合至CHO-K1細胞基因組中。

1.2.4 重組FSH體內(nèi)活性分析

大鼠卵巢、子宮增重是測定促卵泡激素生物學活性最經(jīng)典、最可靠的方法。子宮內(nèi)含有大量的雌激素受體 (ERS)，雌激素通過與該受體結(jié)合，誘發(fā)細胞內(nèi)反應(yīng)，進而表現(xiàn)為子宮組織增生。選取20–23日齡SD雌性大鼠，隨機分成重組FSH高劑量組 (62.5 μg/kg)、中劑量組 (12.5 μg/kg)、低劑量組 (2.5 μg/kg)、Folltropin-V 0.5 g/kg 8次注射組 (每天2次，連續(xù)注射4 d)、Folltropin-V 0.5 g/kg組 (單次注射) 和生理鹽水陰性對照組。腹腔皮下注射重組FSH、陽性藥物 (Folltropin-V) 或生理鹽水。給藥4 d后，處死大鼠，剝離出卵巢與子宮稱重。多聚甲醛固定卵巢，切片、HE染色、鏡檢分析，實驗結(jié)果進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 表達載體pcDNA3.1(+)-FSH的構(gòu)建

轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果雙酶切所得的片段大小與設(shè)計的相符，約750 bp (圖1)，測序結(jié)果與設(shè)計的基因序列比對結(jié)果一致，證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 穩(wěn)定表達FSH細胞系的PCR鑒定

以篩選得到的4株單克隆細胞系和CHO-K1細胞基因組DNA為模板，利用FSH特異引物進行PCR反應(yīng)，結(jié)果以4株單克隆細胞系基因組為模板的PCR產(chǎn)物，得到約750 bp目的片段 (圖2)，與設(shè)計的FSH基因大小相符，而以CHO-K1細胞基因組為模板的PCR產(chǎn)物，沒有檢測到FSH特異性的750 bp條帶，證明FSH基因已整合到CHO-K1 細胞基因組中。

圖1 重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-FSH的PCR和酶切鑒定

圖2 PCR法鑒定CHO-FSH陽性細胞株

2.3 培養(yǎng)上清液的Western blotting分析

培養(yǎng)上清的Western blotting結(jié)果顯示，在 49 kDa 左右有明顯的印記 (圖3)。證實篩選得到的細胞系能表達FSH，進一步用ELISA進行定量分析，結(jié)果顯示培養(yǎng)上清液中重組FSH表達量為3 mg/L。

2.4 重組FSH對大鼠卵巢的影響

大鼠卵巢重量分析 (圖4)，結(jié)果顯示注射重組FSH組，卵巢重量與藥物劑量之間呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。重組FSH 62.5 μg/kg 組與陰性對照組相比具有顯著性差異 (<0.01)；重組FSH 62.5 μg/kg組與連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組相比沒有顯著性差異 (>0.05)；連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組與陰性對照組相比具有顯著性差異 (<0.01)；而單次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組與陰性對照組相比沒有顯著性差異 (>0.05)。重組FSH 62.5 μg/kg、 12.5 μg/kg 組和連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組，大卵泡的數(shù)目(直徑>275 μm) 與陰性對照組相比具有顯著性的差異 (<0.05)；重組FSH 62.5 μg/kg組與連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg 組相比沒有顯著性差異 (>0.05);而單次注射Folltropin-V 0.5g/kg組和重組FSH 2.5 μg/kg組，與陰性對照組相比，沒有顯著性的差異 (>0.05) (圖5)。結(jié)果表明在卵巢、子宮增重和促進卵泡成熟的藥效上，我們得到的重組長效FSH單次注射的藥效與連續(xù)8次注射陽性藥物Folltropin-V的藥效相近。

2.5 長效FSH對大鼠子宮的影響

大鼠注射重組FSH和Folltropin-V結(jié)果顯示：重組FSH 62.5 μg /kg組子宮增重非常明顯，與正常組相比具有顯著性差異 (<0.01)；重組FSH 12.5 μg/kg 組與陰性對照組相比具有顯著性差異 (<0.05)，連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組與陰性對照組相比具有顯著性差異 (<0.05)；而單次注射Folltropin-V 0.5 g/kg 組與陰性對照組相比沒有顯著性差異 (>0.05) (圖6)。

圖3 重組FSH Western blotting鑒定

圖4 重組FSH、Folltropin-V對大鼠卵巢增重的影響

圖5 重組FSH、Folltropin-V對大鼠卵泡成熟的影響

圖6 重組FSH、Folltropin-V對大鼠子宮增重的影響

3 討論

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展, 蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)在臨床治療中發(fā)揮重要的作用，然而大多數(shù)蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的生物半衰期普遍較短, 一方面是蛋白藥物被體內(nèi)大量存在的蛋白酶所分解, 另一方面是分子質(zhì)量小的蛋白分子容易被腎小球濾過而經(jīng)腎臟排泄清除。為了維持療效，往往需要頻繁用藥, 長期的反復注射不僅增加了患者的痛苦, 而且易引發(fā)一系列副反應(yīng)。因此迫切需要延長蛋白藥物的半衰期來避免反復注射帶來的諸多不便，目前第一個長效FSH制劑corifollitropin α已經(jīng)上市。

本文使用含N-糖基化位點的連接序列，將FSHα與β亞基融合成單鏈，表達的長效FSH為單亞基結(jié)構(gòu)，而不是二亞基結(jié)構(gòu)，融合FSH蛋白α羧基端是處于游離狀態(tài)，能與其受體結(jié)合，且β亞基位于融合蛋白的N端，而并沒有影響FSH的生物活性。重組長效FSH蛋白能夠促進大鼠卵巢的增重、卵泡的成熟和子宮的增重。單次注射62.5 μg/kg 重組FSH與連續(xù)8次注射0.5 g/kg Folltropin-V在卵巢、子宮增重和促進卵泡成熟的藥效相當。以上的結(jié)果表明我們得到的重組FSH蛋白能延長在體內(nèi)的半衰期。

本研究獲得的工程細胞株經(jīng)過無血清培養(yǎng)基馴化，懸浮生長，有利于培養(yǎng)規(guī)模的擴大。搖瓶中表達量達3 mg/L，比文獻中報道的表達量要高。此穩(wěn)定表達長效FSH細胞株的獲得，為下一步研制開發(fā)長效FSH蛋白藥物奠定了堅實的臨床基礎(chǔ)。

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(本文責編 郝麗芳)

Expression of human long-acting FSH in CHO cell and its bioactivity

Xiaoping Huang, Xiao Wang, Chunxue Yang, Dongfang Jia, Junsheng Lin, and Yong Diao

1 Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University, Quanzhou 362021, Fujian, China 2 School of Biomedical Sciences Huaqiao University, Quanzhou 362021, Fujian, China

Follicle-stimulating hormone (FSH) is a pituitary glycoprotein hormone that is essential for the development of ovarian follicles and testicular seminiferous tubules. The relatively short half-life of FSHrequires daily injections for more than 10 days that is inconvenient and possibly contribute to the stress perceived by the patients. The goal of the present study was to increase FSH glycosylation, in order to develop a long-acting recombinant FSH. The cDNA of native α and β subunit of human FSH was linked by a sequence with two N-linked glycosylation sites, and the resulted DNA was inserted into pcDNA3.1 vector to generate a recombinant vector of pcDNA3.1-FSH. The pcDNA3.1-FSH was linearized and transfected into CHO-K1, positive transformants were selected by G418 and confirmed by PCR and Western blotting. A single chain recombinant FSH was expressed, with molecular weight of about 49 kDa. The recombinant FSH expression level in CHO-K1 cell strain in serum-free culture was 3 mg/L. Single injection of this recombinant FSH could induce folliculogenesis and ovulation in rats, the efficacy was similar with the commercially available FSH preparation (Folltropin-V) administrated 8 times consecutively. The results suggested a long-acting FSH was produced successfully.

follicle-stimulating hormone, Chinese hamster ovary cells, long acting, serum-free culture

September 12, 2013; Accepted:November 15, 2013

National Natural Science Foundation of China (No. 81271691), Program for International S&T Cooperation Projects of China (No. 2011DFG33320), Key Science & Technology Project of the Fujian Province, China (No. 2013N5007), Project of Huaqiao University (No. 11HZR19).

Yong Diao. Tel/Fax: +86-595-22692516; E-mail: diaoyong@hqu.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 81271691)，國際科技合作項目 (No. 2011DFG33320)，福建省科技重大項目 (No. 2013N5007)，華僑大學校級基金 (No. 11HZR19) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2013-12-17

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131217.1059.002.html