何發(fā)1,2，王欣1,2，郭佳1,2，李崎2，關(guān)鋒1,2

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ldlD-14細(xì)胞表達(dá)NCAM并控制其N-聚糖合成的細(xì)胞模型的建立

何發(fā)，王欣，郭佳，李崎，關(guān)鋒

1 江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122

何發(fā), 王欣, 郭佳, 等. ldlD-14細(xì)胞表達(dá)NCAM并控制其N-聚糖合成的細(xì)胞模型的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(6): 962?971.He F, Wang X, Guo J, et al.Expression of neural cell adhesion molecule and modification of its N-glycan in ldlD-14 cells. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 962?971.

神經(jīng)細(xì)胞黏附分子 (Neural cell adhesion molecule, NCAM) 是一類表達(dá)于神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、骨骼細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞表面的糖蛋白。NCAM在細(xì)胞-細(xì)胞黏附及神經(jīng)細(xì)胞遷移等過程中起著重要作用，也是用來研究多聚唾液酸(Polysialic acid, PSA)的模式蛋白。將來源于小鼠乳腺上皮細(xì)胞NMuMG中的NCAM基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞突變株ldlD-14細(xì)胞中，通過抗生素G418篩選及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)，得到過表達(dá)NCAM的永久轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。利用ldlD-14細(xì)胞的特性，通過在無血清的基本培養(yǎng)基中添加半乳糖與否可以輕易操縱NCAM分子上糖鏈的修飾，為后期研究糖基化對(duì)NCAM分子功能的影響提供工作基礎(chǔ)。

糖鏈，神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，轉(zhuǎn)染，多聚唾液酸，ldlD-14細(xì)胞

糖生物學(xué)是21世紀(jì)生命科學(xué)的前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，其核心內(nèi)容是揭示細(xì)胞糖鏈的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。糖鏈作為生物信息分子參與細(xì)胞生物幾乎所有的生命過程，特別是在細(xì)胞分化、發(fā)育、免疫、老化、癌變、信號(hào)傳遞等生命和疾病過程中起著重要作用。

糖生物學(xué)研究的對(duì)象之一是發(fā)生了糖基化修飾的糖蛋白。糖蛋白上的糖鏈主要是通過兩種糖基化形式形成糖苷鍵連接于蛋白的特定氨基酸上，分別形成N-聚糖和O-聚糖。N-聚糖是連接在蛋白質(zhì)肽鏈中天冬酰胺殘基側(cè)鏈酰胺氮上的寡糖，此類寡糖通常均有一個(gè)核心五糖和類似結(jié)構(gòu)的外周糖鏈。所有的N-聚糖都有一種相同的核心五糖，由3個(gè)甘露糖 (Mannose, Man)和2個(gè)N-乙酰葡糖胺 (N-acetylglucosamine, GlcNAc) 組成 (圖1)。根據(jù)核心五糖中2個(gè)α-Man上連接的糖鏈，N-聚糖可分為3類：高甘露糖型 (High-mannose type)、復(fù)雜型 (Complex type) 和雜合型 (Hybrid type)。而O-聚糖是指通過N-乙酰半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine, GalNAc) 與肽鏈的絲氨酸或蘇氨酸殘基相連接形成的聚糖，它不存在共有的核心結(jié)構(gòu)。在 O-聚糖合成時(shí)，GalNAc第一個(gè)被添加到絲氨酸或蘇氨酸殘基上，然后其他糖類依次添加上去；但是N-聚糖的合成卻不同，它是先合成一個(gè)寡糖前體，再整體轉(zhuǎn)移到多肽的天冬酰胺殘基上。其中，半乳糖 (Galactose, Gal) 存在于大部分復(fù)雜的N-聚糖的分支上，而且也在很多O-聚糖上直接與GalNAc連接。

NCAM屬于免疫球蛋白超家族，是一個(gè)細(xì)胞膜外具有5個(gè)Ig型結(jié)構(gòu)域和2個(gè)三型纖連蛋白 (Fibronectin type Ⅲ, FN3) 結(jié)構(gòu)域的跨膜糖蛋白，其中5個(gè)Ig型結(jié)構(gòu)域上帶有6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。編碼NCAM的mRNA有3種，它們由同一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)不同剪接而成。根據(jù)分子量的不同分別命名為NCAM-180、NCAM-140和NCAM-120。連在NCAM上最主要的糖類是唾液酸，主要以PSA鏈的形式存在于NCAM的第5和第6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)上。唾液酸以α2-3鍵連接于Gal β1-4 GlcNAc β1-2/6-核心五糖結(jié)構(gòu)的N-聚糖上，然后在多聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶 (Polysialyltransferases) 作用下以α2,8-連接形成含有50–100個(gè)唾液酸的線性化多聚物，即PSA。PSA帶有諸多負(fù)電荷，具親水性，因此能夠形成較大的水合半徑。NCAM主要通過胞外的Ig型結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)同類分子間結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附，而PSA的存在使NCAM之間距離過大而失去黏附能力，從而降低了細(xì)胞間的黏附作用。由于PSA主要附著在NCAM上，使得NCAM成為研究PSA化作用的模式蛋白。在NCAM分子的3種亞型中，NCAM-140對(duì)細(xì)胞遷移、腫瘤浸潤(rùn)的作用最明顯，本課題組在前期研究中，發(fā)現(xiàn)小鼠乳腺上皮細(xì)胞 (Normal murine mammary gland epithelial, NMuMG) 在發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程 (Epithelial-mesenchymal transition, EMT) 前后，NCAM在mRNA水平以及蛋白水平表達(dá)明顯上調(diào)，其中NCAM-140的蛋白表達(dá)量最高且上調(diào)幅度最為顯著 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)，因此本文選用NCAM-140為研究對(duì)象。

圖1 N-聚糖的結(jié)構(gòu)[3]

本文使用的ldlD細(xì)胞是一種中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO) 細(xì)胞的突變體，由David M. Kingsley和Monty Krieger篩選得到。由于ldlD細(xì)胞存在UDP-Gal/UDP-GalNAc 4-差向異構(gòu)酶的缺陷，不能利用葡萄糖合成UDP-Gal和UDP-GalNAc，而這兩種糖是糖鏈上Gal和GalNAc的供體，因此導(dǎo)致細(xì)胞中不能產(chǎn)生完整的糖鏈。但是通過外源添加Gal和GalNAc可以完全地糾正該缺陷。正是由于這一缺陷，使得該細(xì)胞成為研究糖鏈生物學(xué)功能非常理想的細(xì)胞模型，可以通過外源添加Gal或不添加Gal操縱ldlD細(xì)胞中蛋白的糖鏈修飾。利用ldlD細(xì)胞這一特性，本實(shí)驗(yàn)將NCAM-140的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到該細(xì)胞中并表達(dá)，用蛋白質(zhì)印跡法 (Western blotting) 篩選NCAM-140過表達(dá)的細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究PSA對(duì)NCAM-140的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

NMuMG細(xì)胞來自于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)ATCC。ldlD-14細(xì)胞來自于美國(guó)華盛頓大學(xué)Sen-itiroh Hakomori實(shí)驗(yàn)室。大腸桿菌JM109及質(zhì)粒pcDNA3.1(+)由本室保存。

細(xì)胞RNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace-α-和T4 DNA連接酶購(gòu)于TOYOBO公司；d Ⅲ和Ⅰ內(nèi)切酶、1 kb DNA ladder marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)于TaKaRa公司；DNA聚合酶和Pro-Light HRP 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)于天根生化科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；T-PER組織總蛋白抽提試劑購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；DMEM培養(yǎng)基、HAM’S/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素溶液購(gòu)于Life Technologies公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Invitrogen公司；抗生素G418和胰島素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；NCAM抗體和ITS (Insulin-transferrin-selenium) 購(gòu)于美國(guó)BD公司；GSL-Ⅱ-FITC (Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lectin Ⅱ, GSL-Ⅱ; Fluorescein isothiocyanate, FITC) 購(gòu)于美國(guó)VECTOR公司；引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和目的基因的擴(kuò)增

從NMuMG細(xì)胞中提取總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。根據(jù)NCAM-140基因序列 (GenBank Accession No. NM_001081445.1)設(shè)計(jì)引物，上游引物序列：5′-CCCAAGCTTATGC TGCGAACTAAGGATCT-3′ (引入酶切位點(diǎn)d Ⅲ)，下游引物序列：5′-CCGCTCGAGT CATGCTTTGCTCTCATTCT-3′ (引入酶切位點(diǎn)Ⅰ)。然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性 40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序得到確認(rèn)。

1.2.2 pcDNA3.1(+)/NCAM真核表達(dá)載體的構(gòu)建

擴(kuò)增得到的NCAM-140基因用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化，然后用d Ⅲ和Ⅰ分別雙酶切NCAM-140基因和pcDNA3.1(+)，酶切產(chǎn)物再純化后在16 ℃下用T4 DNA連接酶連接過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB固體平板上37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取生長(zhǎng)的單菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)單雙酶切及測(cè)序鑒定，得到構(gòu)建成功的重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/ NCAM-140。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

NMuMG細(xì)胞在含10%胎牛血清 (FBS)、10 μg/mL胰島素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，ldlD-14細(xì)胞在含5% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的HAM’S/F-12培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；這兩種細(xì)胞均在37 ℃下含5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

ldlD-14細(xì)胞在含5% FBS的HAM’S/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后吸去培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基輕輕清洗一遍，再用添加了ITS (1∶1 000加入)、Gal (20 μmol/L) 和GalNAc (200 μmol/L) 的無血清HAM’S/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，即可完全修復(fù)ldlD-14細(xì)胞的糖鏈缺陷。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及陽(yáng)性單克隆的篩選

將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NCAM-140和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染ldlD-14細(xì)胞，方法參照Lipofectamine2000的說明書。轉(zhuǎn)染6 h后換含5% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后以1∶10傳代。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換含250 μg/mL G418的培養(yǎng)基篩選2周。挑取單細(xì)胞克隆繼續(xù)在含 250 μg/mL G418的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。然后提取總蛋白用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)，將表達(dá)NCAM-140的細(xì)胞保存并取少量細(xì)胞鋪于10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行第2次單克隆篩選，以得到過表達(dá)NCAM-140的永久轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NCAM表達(dá)

收集細(xì)胞，加入T-PER組織總蛋白抽提試劑，在4 ℃裂解細(xì)胞30 min，離心取上清，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。樣品加入5×蛋白上樣緩沖液混合，煮沸5 min，取20 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至 0.45 μm PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；隨后加入一抗 (1∶1 000)，4 ℃孵育12 h，用1×TBST洗5次；加辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的二抗 (1∶5 000)，室溫作用1 h，用1×TBST洗5次，然后用Pro-Light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑顯色，用Bio-Rad ChemiDoc? XRS+系統(tǒng)掃描成像。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)糖鏈修飾后的NCAM

在6孔板中每孔接種2×10個(gè)細(xì)胞，用含5% FBS的HAM’S/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基后用無血清培養(yǎng)基沖洗一遍；然后分別加入含有5% FBS、ITS、ITS+Gal (5 μmol/L，10 μmol/L或20 μmol/L)+GalNAc (200 μmol/L) 的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h (ITS以1∶1 000加入，以下實(shí)驗(yàn)相同)，用上述方法提取蛋白，測(cè)蛋白濃度，最后用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。

1.2.7 凝集素細(xì)胞染色

在24孔板中放入圓形蓋玻片，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，每孔加入0.5 mL含5% FBS的培養(yǎng)基，細(xì)胞量為2×10個(gè)。培養(yǎng)24 h后換液，分別用含有5% FBS、ITS、ITS+Gal和ITS+Gal+GalNAc的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后吸出培養(yǎng)基，用1×PBS洗2遍，4% 多聚甲醛固定15 min；用1×PBS洗3遍，加入0.1% Triton X-100溶液通透化細(xì)胞10 min；再用1×PBS洗3遍，1% BSA溶液4 ℃封閉過夜。然后用濃度為0.7 μg/mL GSL-II-FITC/PBS室溫下避光孵育3 h，1×PBS洗3遍，Hoechst 33342染色10 min，最后將細(xì)胞爬片倒扣在滴有Glycergel固封劑的載玻片上，晾干后于4 ℃條件下避光保存。用尼康倒置熒光顯微鏡eclipse ti-U在10×60倍下觀察。

1.2.8 流式細(xì)胞檢測(cè)

在12孔板中加入細(xì)胞，每孔細(xì)胞量為1×10個(gè)，在5% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。分別用含有5% FBS、ITS、ITS+Gal (5 μmol/L，10 μmol/L或20 μmol/L)+GalNAc (200 μmol/L) 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后用胰酶消化3 min，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入1×PBS洗2遍，2 000 r/min、4 ℃離心5 min收集細(xì)胞；用1 mL預(yù)冷的1×PBS重懸細(xì)胞，加入1 μg GSL-II-FITC混勻，冰上孵育30 min，然后2 000 r/min、4 ℃離心，用PBS洗去多余的凝集素。用1 mL預(yù)冷的1×PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞管中。用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀FACSCalibur分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增及重組載體的酶切驗(yàn)證

以NMuMG細(xì)胞的cDNA為模板，使用上述引物在高保真DNA聚合酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得NCAM-140基因片段大小為2 547 bp。將NCAM-140基因插入到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建成pcDNA3.1(+)/ NCAM-140真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，篩選到的轉(zhuǎn)化子再提質(zhì)粒進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證 (圖2)。如圖2所示，重組質(zhì)粒經(jīng)過單酶切 (泳道3) 和雙酶切 (泳道2) 后均出現(xiàn)理論上大小的DNA片段。另外，基因測(cè)序結(jié)果也與GeneBank中的NCAM-140序列完全一致，表明pcDNA3.1(+)/NCAM-140真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/NCAM-140的酶切驗(yàn)證

2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NCAM的表達(dá)及在不同處理下糖鏈的連接情況

將pcDNA3.1(+)/NCAM-140重組載體轉(zhuǎn)染到ldlD-14細(xì)胞，得到15株單克隆細(xì)胞，提取這15株細(xì)胞及轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1(+) 細(xì)胞的蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，經(jīng)驗(yàn)證最終得到6株過表達(dá)NCAM-140的細(xì)胞株。如圖3A所示，轉(zhuǎn)染重組載體并過表達(dá)NCAM-140的細(xì)胞在 140 kDa處檢測(cè)到目的條帶，而泳道7的對(duì)照組未檢測(cè)到很明顯的條帶。說明轉(zhuǎn)染的NCAM-140基因在ldlD-14細(xì)胞中得到穩(wěn)定地表達(dá)，建立了小鼠NCAM-140基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

將該ldlD-14/NCAM-140細(xì)胞在分別含有5% FBS、ITS、ITS+GalNAc+Gal (5 μmol/L、 10 μmol/L或20 μmol/L) 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用Western blotting檢測(cè)NCAM-140的表達(dá)及分子量大小。從圖3B中可知NCAM-140的分子量大小具有明顯的區(qū)別。在只添加ITS時(shí)，培養(yǎng)基中沒有合成糖鏈所必需的Gal和GalNAc，NCAM-140上只被有缺陷的短糖鏈修飾，分子量最小。當(dāng)添加不同濃度的Gal時(shí)，細(xì)胞合成糖鏈的缺陷逐漸被糾正。在含5% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞也能合成少量完整的糖鏈，這是由于FBS含有少量的Gal所致。而當(dāng)Gal的濃度增加到20 μmol/L時(shí)，NCAM-140的泳動(dòng)速率最慢，表示NCAM上合成有較為完整的糖鏈。

圖3 Western blotting檢測(cè)ldlD-14中NCAM-140的表達(dá)

2.3 凝集素檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的糖鏈完整性

凝集素GSL-Ⅱ能專一性地識(shí)別寡糖鏈非還原末端上以α-或β-連接的GlcNAc。由于N-聚糖除高甘露糖型外，連接五糖核心的結(jié)構(gòu)大部分為Gal β1-4 GlcNAc結(jié)構(gòu)。ldlD細(xì)胞存在UDP-Gal和UDP-GalNAc 4-差向異構(gòu)酶的缺陷，使細(xì)胞在只含有葡萄糖的培養(yǎng)基中不能合成UDP-Gal和UDP-GalNAc，最終導(dǎo)致細(xì)胞合成的N-聚糖不完整，其末端多以GlcNAc結(jié)束。而在基本培養(yǎng)基中添加Gal和GalNAc后，細(xì)胞可以通過補(bǔ)救途徑合成UDP-Gal和UDP-GalNAc，進(jìn)而產(chǎn)生完整的N-聚糖。如圖4A所示，在含ITS的無血清培養(yǎng)基中，ldlD/NCAM-140細(xì)胞合成的N-聚糖末端暴露出更多的GlcNAc，因此對(duì)GSL-II-FITC的結(jié)合最強(qiáng)，也產(chǎn)生最強(qiáng)的熒光信號(hào)。因此在含有5% FBS的培養(yǎng)基中，ldlD/NCAM-140細(xì)胞合成的N-聚糖末端的GlcNAc有小部分被血清中含有的少量Gal進(jìn)一步修飾，導(dǎo)致熒光信號(hào)略微減弱。而在含有足夠的Gal或GalNAc的無血清培養(yǎng)基中，過量的Gal中和了N-聚糖末端的GlcNAc，保證了ldlD/NCAM-140細(xì)胞合成N-聚糖的完整性，該條件下GSL-II-FITC的結(jié)合能力最弱，其熒光信號(hào)也相應(yīng)最弱。由于NCAM主要被N-聚糖修飾，而GalNAc在此過程中幾乎沒有參與，因此GalNAc對(duì)GSL-II-FITC結(jié)合細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號(hào)沒有影響。

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了在不同濃度的Gal培養(yǎng)條件下，ldlD/NCAM-140細(xì)胞對(duì)GSL-II-FITC的結(jié)合能力。如圖4B所示，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)在含ITS的無血清的培養(yǎng)基中，細(xì)胞N-聚糖末端多為GlcNAc，熒光信號(hào)最強(qiáng)。添加5% FBS或者逐漸提高Gal的濃度，ldlD/NCAM-140細(xì)胞N-聚糖進(jìn)一步發(fā)生修飾，導(dǎo)致GSL-II結(jié)合能力減弱，因此在流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果中表現(xiàn)出熒光信號(hào)逐漸減弱，該結(jié)果與熒光顯微細(xì)胞照相的結(jié)果完全一致。

3 討論

蛋白質(zhì)、核酸和糖是構(gòu)成生命的三類大分子，由于糖鏈的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，不像核酸和蛋白質(zhì)具有通用的模板，而且糖鏈結(jié)構(gòu)測(cè)定及糖鏈合成等關(guān)鍵技術(shù)還不成熟，導(dǎo)致對(duì)糖鏈的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的研究，糖鏈對(duì)生命的影響仍然存在太多的奧秘亟待探索和研究。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，糖生物學(xué)越來越被人們所重視，已然成為21世紀(jì)生命科學(xué)新的研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。其中，糖蛋白作為最普遍也是最重要的糖綴合物，已成為研究糖鏈結(jié)構(gòu)與功能的重要實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其中的NCAM是一個(gè)用來研究糖鏈尤其是PSA鏈合成及功能的模式糖蛋白。因此，本研究選擇NCAM-140為研究對(duì)象，通過轉(zhuǎn)染使其在糖鏈合成存在缺陷的ldlD-14細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)，可以人為地控制NCAM上糖鏈的修飾，為后續(xù)研究NCAM上糖鏈對(duì)其蛋白功能的行使提供細(xì)胞模型。

圖4 ldlD-14細(xì)胞的凝集素GSL-II-FITC染色

本研究從小鼠胸腺上皮細(xì)胞中克隆NCAM-140基因，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/NCAM-140。將該重組載體轉(zhuǎn)染ldlD-14細(xì)胞，成功篩選到過表達(dá)NCAM-140的單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，用Western blotting檢測(cè)驗(yàn)證了NCAM-140的表達(dá) (圖3A)。通過對(duì)ldlD-14/NCAM-140細(xì)胞進(jìn)行凝集素染色顯示，該細(xì)胞在含有Gal和GalNAc的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，ldlD-14細(xì)胞中有缺陷的糖鏈能完全被修復(fù) (圖4A和4B)。此外，如圖3B所示，分別在含有5% FBS、ITS、ITS+Gal和ITS+Gal+GalNAc的培養(yǎng)條件下分別對(duì)NCAM-140分子量大小的檢測(cè)結(jié)果也間接說明：可以利用ldlD-14細(xì)胞的特點(diǎn)調(diào)控NCAM分子上N-聚糖的延長(zhǎng)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)NCAM多聚唾液酸化的控制，為后續(xù)對(duì)PSA的研究提供理想的細(xì)胞模型。

PSA主要附著在NCAM分子上，PSA在胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較高，在成人組織中表達(dá)較少，而且其表達(dá)也局限于腦部神經(jīng)組織，但在某些特定腦區(qū)如嗅球和海馬，PSA的表達(dá)水平仍然很高。NCAM上的PSA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞遷移、軸突生長(zhǎng)、生物節(jié)律的控制、神經(jīng)可塑性記憶的形成都有一定影響，而且在嗅球形成中也起重要作用。表達(dá)無唾液酸修飾NCAM的小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)軸突生長(zhǎng)減弱，免疫力低下，甚至無法發(fā)育生長(zhǎng)，說明了PSA在大腦發(fā)育中的重要作用。此外，在一些惡性腫瘤組織中，如成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤等也發(fā)現(xiàn)了PSA的高表達(dá)，高表達(dá)的PSA可以顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的分離、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

近來，Lehembre等發(fā)現(xiàn)NMuMG和MCF 7細(xì)胞在發(fā)生EMT時(shí)，NCAM的表達(dá)顯著上升，其亞細(xì)胞定位改變，并與P59結(jié)合后激活了FAK激酶介導(dǎo)的信號(hào)通路，而阻礙了FGFs介導(dǎo)的PLCγ/PKCα和Ras/Raf/MAPK信號(hào)通路，提高細(xì)胞的侵襲與遷移能力。EMT是腫瘤細(xì)胞惡性增殖及轉(zhuǎn)移的重要過程，而NCAM以及NCAM上的PSA鏈都與癌細(xì)胞的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此研究NCAM上的PSA以及PSA對(duì)NCAM功能的影響，將有助于深入了解PSA及NCAM在癌癥發(fā)生及轉(zhuǎn)移中的作用。由于PSA是與N-聚糖末端的Gal形成糖苷鍵而連接在NCAM上的，所以，本研究構(gòu)建的ldlD-14/NCAM-140細(xì)胞模型，可以通過在基本培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)Gal濃度的大小以方便地操縱NCAM上PSA鏈的合成，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑檫M(jìn)一步研究PSA的修飾以及PSA鏈的長(zhǎng)短對(duì)NCAM介導(dǎo)的細(xì)胞粘附及相關(guān)信號(hào)通路影響的研究提供了良好的基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Expression of neural cell adhesion molecule and modification of its N-glycan in ldlD-14 cells

Fa He, Xin Wang, Jia Guo, Qi Li, and Feng Guan

1 Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Neural cell adhesion molecule (NCAM) is a glycoprotein expressing on the surface of neurons, glial cells, bone cells and natural killer cells. NCAM plays an important role in the process of cell - cell adhesion and cell migration, and is also a model protein to study polysialic acid. In this paper, NCAM gene from mouse mammary gland cells (NMuMG) was cloned into eukaryotic expression vectors pcDNA3.1(+) and transfected into mutant Chinese hamster ovary cells ldlD-14. The stable transfection over-expressing NCAM was obtained through the G418 selection and confirmed by Western blotting. Due to unique characters of ldlD-14 cells, carbohydrate chain of NCAM molecule can be easily manipulated with or without adding galactose in the serum free medium, and this modification can provide the basis for further studies on the effect of glycosylation on NCAM molecular function.

carbohydrate chain, neural cell adhesion molecule, transfection, polysialic acid, ldlD-14 cell

September 13, 2013; Accepted:February 10, 2014

National Natural Science Foundation of China (No. 81201572).

Qi Li. Tel:+86-510-85918176; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn Feng Guan. Tel: +86-510-85918126; E-mail: fengguan@jiangnan.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81201572) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-03-10

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130478.html