王保全1，平娟1，李峰1，張永州1，劉翠2，龐曉斌3

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用殼聚糖納米磁性微球純化血紅細(xì)胞超氧化物歧化酶

王保全，平娟，李峰，張永州，劉翠，龐曉斌

1 河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院，河南開封 475001 2 中國科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101 3 河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475001

王保全, 平娟, 李峰, 等. 用殼聚糖納米磁性微球純化血紅細(xì)胞超氧化物歧化酶. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(6): 990?994.Wang BQ, Ping J, Li F, et al. Purification of superoxide dismutase from blood erythrocyte by nano magnetic chitosan microspheres. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 990?994.

本研究旨在用殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球純化血紅細(xì)胞超氧化物歧化酶。采用了接枝共聚法，以KSO為引發(fā)劑，使殼聚糖 (CTS) 與聚丙烯酸 (PAA) 進(jìn)行自由接枝共聚合成含有兩性基團(tuán) (-NH3，-COOH) 的殼聚糖-聚丙烯酸納米微球。化學(xué)共沉淀法制備FeO磁流體，以戊二醛為交聯(lián)劑，制備殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球。用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)磁性微球結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測。JEM-4000EX電鏡技術(shù)對(duì)微球粒徑，形貌進(jìn)行表征。SOD試劑盒測定各步驟Cu-ZnSOD酶活性。結(jié)果表明，殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球有較好的粒徑分布、磁響應(yīng)性及蛋白吸附特性。純化后酶比活性達(dá)6 727 U/mg，產(chǎn)品得率21.1%，活性回收85.7%。殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球經(jīng)血液純化血紅細(xì)胞SOD具有可再生性、易操作性，其純化效果取決于金屬Cu的螯合程度。

聚丙烯酸，納米磁性微球，超氧化物歧化酶，純化

殼聚糖是甲殼素脫乙?；频玫囊环N高分子氨基多糖，無毒無味，廣泛存在于蝦、蟹及貝殼中，是地球上豐富的化合物之一。由于其分子鏈上具有豐富的羥基和氨基使其極易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而具備多種功能，因而廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品、化工、環(huán)境等領(lǐng)域，但天然殼聚糖具有水不溶性，主側(cè)鏈難以反應(yīng)等特點(diǎn)，天然殼聚糖具有水不溶性，從而限制了其應(yīng)用，隨著人們對(duì)殼聚糖作為一種生物大分子聚合物和醫(yī)藥緩控釋材料等方面的應(yīng)用越來越感興趣，對(duì)殼聚糖的化學(xué)改性也進(jìn)行了越來越多的研究。特別著重建立殼聚糖主側(cè)鏈各種優(yōu)越官能團(tuán)的成熟分子結(jié)構(gòu)以及殼聚糖的接枝共聚，改性后的殼聚糖作為吸附劑的研究已見大量報(bào)道，如Chang等制備了用于去除Cu的殼聚糖結(jié)合FeO磁性納米微粒，Sararikova通過改性殼聚糖粒子一步操作部分純化了馬鈴薯塊莖中的凝集素。

殼聚糖納米微球用于酶固定化是指物理吸附或者化學(xué)方法將酶固定到特定的載體上，以提高酶操作穩(wěn)定性和反復(fù)利用酶的技術(shù)。常用的固定化方法很多：如吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法等，用于固定化酶的高分子載體有活性炭、多糖及多聚酰胺 等，磁性高分子微球是指內(nèi)部含有磁性的金屬或其氧化物 (如鐵、鈷、鎳) 的超細(xì)粉末，與非磁性材料相比，磁性高分子微球作為固定化酶的載體研究具有以下優(yōu)點(diǎn)：有利于酶從反應(yīng)體系中分離回收，操作簡單，對(duì)于雙酶反應(yīng)體系，當(dāng)一種酶失活較快時(shí)，可以用磁性材料來固定另一種酶，回收和反復(fù)使用，降低生產(chǎn)成本。其次，將固定化酶放入磁場穩(wěn)定的流動(dòng)床反應(yīng)器中，可以減少持續(xù)反應(yīng)體系中的操作，適合大規(guī)模化操作。另外可利用外部磁場控制固定化酶的運(yùn)動(dòng)方式和方向，替代傳統(tǒng)的攪拌方式，提高了固定化酶催化效率。本文以聚丙烯酸和殼聚糖為原料，制備磁性殼聚糖-聚丙烯酸微球，并首次將磁分離技術(shù)應(yīng)用于血液SOD的純化，達(dá)到了很好的純化效果。

1 材料與方法

1.1 材料

聚丙烯酸 (上海阿拉丁試劑總廠，分子量5 000)，聚丙烯酸鈉 (PAAS) (北京順義希濤化學(xué)試劑廠，固含量3.45%)，殼聚糖 (脫乙酰度>90%)，低分子量Maker (華美生物技術(shù)公司)，SOD測總活性試劑盒 (南京建成生物)，JEM-4000EX透射電子顯微鏡，紫外分光光度儀器 (日本島津公司)，F(xiàn)TS-3000紅外光譜儀 (美國戴爾公司)，F(xiàn)D-IC-50冷凍干燥機(jī) (北京博益康儀器公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 FeO磁流體的制備

采用化學(xué)共沉淀法制備FeO磁流體。

1.2.2 聚丙烯酸-殼聚糖的接枝共聚

準(zhǔn)確稱取0.2 g的殼聚糖粉，以100 mL的1%醋酸溶解，磁力攪拌30 min，使之與20 mL 20%的聚丙烯酸溶液，4 mL的0.1 g/L的過硫酸鉀溶液在燒杯中混合均勻，70 ℃條件回流反應(yīng)45 min去除未反應(yīng)完全的聚丙烯酸，冷凍干燥得殼聚糖-聚丙烯酸微球。

1.2.3 磁性納米微球的制備及對(duì)Cu的螯合

稱取一定量殼聚糖-聚丙烯酸納米微球粉末，配置成5%的殼聚糖乙酸溶液，加入一定量的冷凍干燥后的FeO納米粒子，超聲分散15 min，緩慢加入由液體石蠟、Span-80、吐溫-60、正丁醇等組成的油相液體中，混合均勻，加入一定量的25%的戊二醛為交聯(lián)劑，交聯(lián)一定時(shí)間，7 000 r/min離心15 min，分別用蒸餾水和丙酮多次洗滌，冷凍干燥即得殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球，準(zhǔn)確稱取0.2 g的殼聚糖-聚丙烯酸磁性微球4等份，分別置于100 mL的錐形瓶中，配制0.01 mol/L Cu離子溶液，按文獻(xiàn)[9]方法螯合Cu，并繪制Cu吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.4 血液SOD的初步分離

新鮮血液4 000 r/min離心45 min，取100 mL血球，等體積0.6% Tritonx-100蒸餾水溶血，再加溶血體積20%聚丙烯酸鈉溶液，水浴加熱到70 ℃時(shí)加10%溶血體積的氯化銅(濃度10%) 作為激活劑，恒溫10 min，細(xì)紗過濾，收集得到淺綠色粗酶液，加上述酶液體積2倍濾液體積預(yù)冷–4 ℃丙酮，離心收集沉淀，用pH為7.6的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，將上述酶液裝入超濾杯中，以分子量為10 000 Da的超濾膜截留，收集膜上酶液即為粗酶液。

1.2.5 蛋白含量和活性測定

按考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量，線性回歸方程為：= 0.092 5–0.012，= 0.997 3，SOD活性測定按南京建成生物試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米親和微球的磁響應(yīng)性檢測

準(zhǔn)確稱取0.4 g納米磁性微球2等份，置于 100 mL燒杯中，制備成混懸液，一份加強(qiáng)磁場，一份在自然重力場中，于480 nm處測定上清液中的透光率，結(jié)果顯示：在外加磁場作用下，聚丙烯酸-殼聚糖納米磁性微球在5 min時(shí)，上清液透光率達(dá)81.2%，經(jīng)過10 min后上清液透光率由30.5%上升到94.1%，在自然重力場中，45 min內(nèi)其透光率從29.1%上升到56%，說明聚丙烯酸-殼聚糖納米磁性微球有較好的磁響應(yīng)性和懸浮穩(wěn)定性。

2.2 殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球紅外光譜分析

圖1是殼聚糖、聚丙烯酸接枝共聚后產(chǎn)物的紅外光譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)紅外圖譜庫中的殼聚糖、聚丙烯酸譜圖對(duì)照得知：接枝共聚后譜圖出現(xiàn)了幾個(gè)新特征峰：3 400–3 500 cm處為O-H 伸縮振動(dòng)與N-H伸縮振動(dòng)重疊而成的多重吸收峰，630 cm處為典型的是Fe-O鍵特征峰，在1 100 cm附近出現(xiàn)了C-O和C=O鍵的特征吸收峰，1 524 cm附近是由-CONH-的N-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)和C-N鍵伸縮振動(dòng)引起，同時(shí)1 644 cm附近可能是由NH的N-N面內(nèi)彎曲振動(dòng)引起的，和純殼聚糖相比，峰位置移向了較高的波數(shù)，另1 100 cm處出現(xiàn)的特征吸收峰，是-CH=CH和C-H的面外搖擺振動(dòng)峰或者C-O和C=O鍵的特征吸收峰，或者二者的重疊峰，說明其分子結(jié)構(gòu)中存在C=C雙鍵。表明戊二醛與殼聚糖接枝共聚后的進(jìn)行了交聯(lián)，生成了目標(biāo)物。

圖1 殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球紅外圖譜

2.3 殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球的電鏡形態(tài)觀察

圖2是FeO納米粒子在EM-4000EX下放大100萬倍的電鏡圖，圖3是磁性殼聚糖納米微球放大50萬倍的電鏡圖，F(xiàn)eO納米粒子被完整的包裹在殼聚糖中，經(jīng)計(jì)算其粒徑大小在150 nm左右。

2.4 磁性納米磁性微球?qū)u的螯合作用

納米磁性微球螯合Cu后對(duì)血液SOD可以起到很好的吸附作用，這與Cu-ZnSOD的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，見圖4。

2.5 殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球?qū)OD的特異性吸附作用

準(zhǔn)確稱取6等份的螯合Cu的納米磁性微球溶解于適量的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液pH 7.6中，分別加入已知酶活性的SOD粗酶液2、4、6、8、10、12 mL，以緩沖液補(bǔ)充至相同體積，室溫?cái)嚢栉?0 min，磁分離收集并測定上清液中的酶活力，總活力減去上清液酶活即為磁性微球?qū)OD的吸附活性量，由圖5可以看出，螯合Cu的磁性微球?qū)ρ篠OD的最大活性吸附量為6 727 U/mg。

圖2 Fe3O4納米微球電鏡圖 (×100萬倍)

圖3 殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球(×50萬倍)

圖4 納米磁性微球?qū)饘巽~離子的吸附作用

2.6 納米磁性微球純化血液SOD各步結(jié)果

以丙酮沉淀后的粗品為活性對(duì)照，由表1各步可以看出，制備的殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球純化血液超氧化物歧化酶得到了較高的酶活性，達(dá) 6 727 U/mg，活性回收達(dá)85.7%，產(chǎn)品得率達(dá)21.1%。

圖5 殼聚糖-聚丙烯酸納米磁性微球?qū)OD的特異性吸附作用

表1 磁性納米微球純化SOD結(jié)果表

3 討論

近年來，結(jié)合功能性磁性吸附離子技術(shù)的應(yīng)用得到廣泛關(guān)注，磁分離技術(shù)具有快速、溫和、規(guī)模化、制動(dòng)化等特點(diǎn)，已在許多領(lǐng)域都得到可靠的證實(shí)，如分子診斷、腫瘤和細(xì)胞篩選，環(huán)境領(lǐng)域等。實(shí)驗(yàn)將磁分離技術(shù)應(yīng)用于血液Cu-ZnSOD的吸附純化，取得了很好的效果，另值得注意的是用殼聚糖包裹的磁流體即使沒有偶聯(lián)配基，也對(duì)模擬藥物 (如蛋白質(zhì)) 有一定的固載和吸附作用，這是因?yàn)槲⑶蛑写嬖诘娜┗偷鞍姿幬镏械陌被嗷プ饔玫慕Y(jié)果。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Purification of superoxide dismutase from blood erythrocyte by nano magnetic chitosan microspheres

Baoquan Wang, Juan Ping, Feng Li, Yongzhou Zhang, Cui Liu, and Xiaobin Pang

1 Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, Henan, China 2 Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 3 Pharmaceutical College of Henan University, Kaifeng 475001, Henan, China

Nano magnetic microspheres prepared by chitosan and poly acylic acid were applied to purifying superoxide dismutase from blood erythrocyte. Chitosan-polyacyilc acid graft copolymer was synthesized by free radical graft copolymerization with potassium persulfate as inititator. To prepare FeOmagnetic fluids with chemical coprecipitation, chitosan-polyacylic nano magnetic microspheres were prepared with glutaraldehyde as crosslinking agent. Structure of nano magnetic microspheres was detected by FT-IR spectrometer. Particle size and morphology were characterized by JEM-4000EX technology. Chitosan-polyacylic nanometer microspheres have good paticle cize distribution, magnetic responsiveness and protein adsoption. Activity, product yield and activity recovery of SOD after purification reached 6 727 U/mg, 21.1%, and 85.7% respectively. Purification of blood superoxide dismutase by chistosan-polyacylic acid microspheres has its renewable and feasible nature.

poly acrlic acid, nano magnetic microspheres, superoxide dismutase, purification

September 7, 2013; Accepted: March 20, 2014

Kaifeng Municipal Science and Technology Bureau Program (No. 1403018), National Natural Science Foundation of China (No. 81273652).

Xiaobin Pang. Tel: +86-378-3906303; E-mail: pxb0411@163.com

開封市科技局項(xiàng)目(No. 1403018)，國家自然科學(xué)基金(No. 81273652) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-04-15

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130467.html