周月1，趙許朋1，吳秀華1，張艷玲1，張林1，羅克明1,2，湯紹虎1,2

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農桿菌介導基因導入‘紅陽’獼猴桃及分子鑒定

周月，趙許朋，吳秀華，張艷玲，張林，羅克明，湯紹虎

1 西南大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715 2 西南大學生命科學學院，重慶 400715

周月, 趙許朋, 吳秀華, 等. 農桿菌介導LJAMP2基因導入‘紅陽’獼猴桃及分子鑒定. 生物工程學報, 2014, 30(6): 931?942.Zhou Y, Zhao XP, Wu XH, et al.Agrobacterium-mediated transformation of LJAMP2 gene into ‘Red Sun’ kiwifruit and its molecular identification. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 931?942.

為了獲得抗?jié)儾〉摹t陽’獼猴桃轉基因植株，以紅陽獼猴桃試管苗葉盤為轉基因受體材料，通過根癌農桿菌介導將CaMV35S啟動子調控下的基因導入紅陽獼猴桃。450個葉盤與攜帶表達載體質粒pBI121的根癌農桿菌菌珠LBA4404共培養(yǎng)2 d后，轉入含25 mg/L Kan的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d，15 d 轉接1次，之后30 d繼代1次。結果表明，在MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA篩選培養(yǎng)基中，Kan芽率達85%以上，在1/2 MS+0.8 mg/L IBA培養(yǎng)基中，Kan芽生根率達100%。共獲得Kan再生植株40株，經GUS組織染色和PCR分析證明，其中23株為轉基因植株。陽性率為57.50%，轉化率達5.11%?？?jié)儾』蛞殉晒爰t陽獼猴桃，為紅陽獼猴桃的抗病基因工程育種奠定了基礎。

‘紅陽’獼猴桃，潰瘍病，基因，遺傳轉化，根癌農桿菌

獼猴桃營養(yǎng)極為豐富，被譽為“水果之王”。到2009年，中國獼猴桃栽培面積和產量均居世界第一，分別占全球份額的53%和38%?！t陽’獼猴桃為我國特有紅心品種，果肉翡翠綠色，橫切面自果心向外具放射狀血紅色條紋，總糖含量達13.45%，高出世界流行品種‘海沃德’近5%，口感特好，堪稱獼猴桃極品；2002年被列為世界第3代獼猴桃首選品種；2004年起受國家原產地產品保護。其栽培面積日益擴大，商品果產量連年增加，而目前產品數量和質量尚不能滿足市場需求。

獼猴桃屬典型呼吸躍變型果實，采后室溫下只能貯藏一星期左右。貨架期太短，貯藏和運輸不便，采后成本增加；同時，獼猴桃病蟲害每年都會給主產區(qū)造成巨大經濟損失。近年來，獼猴桃潰瘍病傳播迅速，危害程度日趨嚴重。秦嶺北麓主產區(qū)中華系品種潰瘍病感病園達90%，感病株達60%以上，每年因此平均減產20%左右。單純依靠常規(guī)育種和噴灑農藥不能有效解決獼猴桃產業(yè)中的突出問題，迫切需要以紅陽獼猴桃為基礎培育出一個高抗病性且耐貯保鮮的獼猴桃新品種。

植物基因工程為獼猴桃種質改良開辟了新途徑。獼猴桃的遺傳轉化始于上世紀90年代，轉化方法普遍為農桿菌介導法，轉化受體從開始以莖段、愈傷為主，發(fā)展到近年以葉盤為主。近年來，人們將大豆b-1,3-內切葡聚糖酶基因、番茄ACC合成酶和獼猴桃ACC氧化酶 (ACO，乙烯合成酶) 反義基因導入獼猴桃，提高了植株的抗病性，獲得了轉化苗和降低了ACO基因的表達量。近年，抗菌肽 (Antimicrobial peptides，AMPs) 在植物基因工程領域廣受關注。2006年，Yang等從益母草種子中分離到一種新的非專一性脂轉移類蛋白 (nsLTPs) 的抗菌肽，命名為LJAMP2。成熟的LJAMP2由91個氨基酸組成，表觀分子量6.2 kDa，等電點為8.67。煙草、番茄分別轉入nsLTPs基因 (、)和后，抗病性顯著提高。Yang等克隆了LJAMP2基因，在煙草、毛白楊和油菜中表達，表現(xiàn)出廣譜抗菌活性。然而，現(xiàn)有的獼猴桃基因工程報道，主要進行的是遺傳轉化體系的建立，實際轉入目的基因的不多，除涉及花器官發(fā)育、激素代謝、耐鹽和果實呼吸外，涉及抗病基因的太少，LJAMP2基因還未被利用。本試驗在趙許朋等成功建立紅陽獼猴桃葉盤高頻直接再生體系基礎上，采用根癌農桿菌介導法首次將導入紅陽獼猴桃，并獲得了轉基因植株，為紅陽獼猴桃的抗病基因工程育種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與感染受體

植物材料為‘紅陽’獼猴桃 (cv. ‘Red Sun’) 試管苗，由本實驗室保存；感染受體為源于幼嫩葉片的葉盤 (大小約0.5 cm×0.5 cm)。

1.1.2 質粒與菌株

轉化所用質粒為pBI121，其表達載體：：含有報告基因、CaMV 35S啟動子調控的目的基因和標記基因。質粒通過凍融法轉入根癌農桿菌菌株LBA4404中。工程菌株LBA4404由西南大學生命科學學院羅克明教授提供。

1.2 方法

1.2.1 農桿菌的培養(yǎng)與活化

農桿菌 (工程菌株LBA4404) 的培養(yǎng)與活化參照高月等的方法進行。菌液離心后用含0.1 mmol/L乙酰丁香酮 (AS) 的液體MS培養(yǎng)基重懸浮，然后用于轉化。

1.2.2 農桿菌侵染與共培養(yǎng)

無菌條件下，將葉盤接種到出芽培養(yǎng)基上預培養(yǎng)3 d；放入濃度為=0.5的菌液中，輕微振蕩，侵染10 min；瀝干，用無菌濾紙吸去多余菌液，平放在含0.1 mmol/L AS的出芽培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d(暗培養(yǎng)，25 ℃±2 ℃)；取出，無菌水沖洗4次，接種到含25 mg/L卡那霉素+400 mg/L羧芐青霉素的出芽培養(yǎng)基上篩選Kan抗性芽 (Kan芽)。前40 d每15 d轉接1次 (30 d暗+10 d光照培養(yǎng))，之后每30 d繼代一次 (光照培養(yǎng))。不定芽長至高3 cm以上時，切下，先插入固體生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，后轉入充分吸附液體生根培養(yǎng)基的珍珠巖基質中培養(yǎng)15 d (光照培養(yǎng))，得到Kan植株。洗凈其根部基質，移栽到溫室營養(yǎng)缽中。出芽培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA，不定芽繼代為MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L GA，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.8 mg/L IBA；培養(yǎng)溫度 (25±2) ℃，光照強度4 500 lx (16 h/d)。篩選有關轉化因素的水平時，變化篩選因素水平，其他因素的水平依此不變。每處理接種8?10個葉盤，重復3?4次。

1.2.3 GUS組織染色與轉基因植株的PCR檢測

GUS基因瞬時表達的檢測參照尚霄麗等的方法進行，檢測材料為Kan叢芽或Kan植株的葉片。

紅陽獼猴桃基因組DNA以葉片為材料采用改良CTAB法提取。轉基因植株PCR檢測以GUS陽性植株的基因組DNA為模板，通過擴增標記基因和目的基因進行篩選。根據Yang等的報道，分別設計特異引物。基因的上游引物序列為5'-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3'，下游引物序列為5'-TCGGGAGCGGCGATACCGTA-3'；基因的上游引物序列為5'-ATGGCTGCCTTGATCAAGTTG-3'，下游引物序列為5'-CAGTGCACCTTTGAGCAATC-3'。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 部分轉化因素水平的確定

2.1.1 卡那霉素 (Kan) 選擇壓的確定

將葉盤直接接種在含不同濃度Kan的出芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)4?6周。結果 (表1) 表明，在未添加Kan的培養(yǎng)基中，葉盤分化正常。培養(yǎng)6周后，出芽率達100%，每個葉盤平均出芽18個以上 (圖1A)；隨著培養(yǎng)基中Kan濃度的升高，葉片分化受到明顯抑制。Kan=20 mg/L時，培養(yǎng)6周后葉片雖能脫分化和低頻 (8.56%) 產生愈傷組織，但不能分化出不定芽；Kan≥25 mg/L時，愈傷組織和不定芽的形成完全被抑制，外植體逐漸褐化、死亡 (圖1B)，說明紅陽獼猴桃葉片在直接再生不定芽的過程中對Kan比較敏感。因此，在本試驗中，用于葉盤轉化的Kan選擇壓確定為25 mg/L。

2.1.2 羧芐青霉素 (Carb) 和頭孢霉素 (Cef) 抑菌濃度的確定

葉盤經農桿菌侵染和共培養(yǎng)后，接種到含不同濃度Carb和Cef的出芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周。結果 (表2) 表明，100?600 mg/L Cef不能抑制農桿菌的生長。100?500 mg/L Cef時，葉盤因污染全部死亡；600 mg/L Cef時，葉盤成活率僅2.14%。而100?500 mg/L Carb能不同程度地抑制農桿菌生長。隨著Carb濃度的提高，葉盤成活率提高。200 mg/L Carb時 (圖1C)，平均成活率較低 (8.93%)；400 mg/L和 500 mg/L Carb時，成活率達100%。但500 mg/L Carb明顯影響不定芽再生，而400 mg/L Carb無明顯影響 (圖1D)。因此，本試驗采用 400 mg/L Carb抑制共培養(yǎng)后篩選過程中農桿菌的生長。

2.1.3 葉盤預培養(yǎng)和農桿菌侵染時間對轉化頻率的影響

葉盤在農桿菌侵染前經不同時間的預培養(yǎng)，共培養(yǎng)前用農桿菌侵染不同時間，并在抗性篩選結束后，取Kan芽的葉片進行GUS染色。試驗結果表明，預培養(yǎng)1?5 d后，轉化率 (以瞬時表達率表示，后同) 均顯著提高，分別比對照 (61.78%) 提高9.02%、25.07%、41.39%、36.16%和21.95% (圖2A)。其中，預培養(yǎng)3 d的轉化率最高 (87.35 %)，且與預培養(yǎng)1 d、2 d和5 d均存在顯著差異 (≤0.05)，僅與4 d無顯著差異 (＞0.05)。因此，本試驗葉盤預培養(yǎng)的適宜時間為3 d。

農桿菌侵染0.5?30 min后，其轉化率的變化趨勢與葉盤預培養(yǎng)相同 (圖2B)。其中，侵染10 min轉化率最高 (57.20%)，比0.5、5、15和30 min分別提高140.34%、23.81%、33.64%和21.34倍，且與它們均存在顯著差異。因此，本試驗農桿菌侵染的最佳時間為10 min。

表1 Kan對葉片外植體愈傷組織和不定芽誘導的影響

Note: different letters a, b, c, d in a column mean significant difference in different samples (≤0.05). The same as table 2.

圖1 抗生素對‘紅陽’獼猴桃葉片不定芽分化的影響

表2 羧芐青霉素和頭孢霉素對選擇培養(yǎng)中外植體成活率的影響

圖2 葉盤預培養(yǎng)(A) 和農桿菌侵染時間(B) 對轉化頻率的影響

2.1.4 乙酰丁香酮對轉化頻率的影響

葉盤被農桿菌侵染后在共培養(yǎng)期間，于共培養(yǎng)基中加入不同濃度的乙酰丁香酮 (AS)，取Kan芽的葉片進行GUS染色。結果表明，AS對轉化頻率有顯著影響 (圖3)。培養(yǎng)基中添加 0.1、0.2、0.3和0.5 mmol/L AS時，轉化頻率比對照 (58.67%) 分別提高25.16%、22.99%、15.66%和6.07%。其中，添加 0.1、0.2和0.3 mmol/L AS時，轉化頻率與對照均存在顯著差異，而相互間無顯著差異。因此，本試驗確定在共培養(yǎng)基中添加0.1 mmol/L AS，以提高紅陽獼猴桃葉盤的遺傳轉化頻率。

圖3 乙酰丁香酮對轉化頻率的影響

2.2 抗性植株葉片的GUS染色

本試驗通過葉盤預培養(yǎng)、農桿菌侵染、共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)，共獲得獨立的Kan植株40株，移栽后生長正常 (圖4A)。因植物表達載體：：含有報告基因，故首先對Kan植株的葉片進行GUS組織染色。結果表明，在被檢測的40株Kan植株中，有23株呈藍色 (圖4B)，為GUS陽性再生植株；其余17株和未轉化的植株沒有顯示出藍色 (圖4C)。初步表明外源目的基因已整合到紅陽獼猴桃部分Kan植株的基因組中。

2.3 轉基因植株的PCR檢測

對23株GUS陽性再生植株，以其基因組DNA為模板，以：：質粒DNA (圖5A) 為陽性對照，非轉化植株的基因組DNA為陰性對照，利用特異性引物，分別對標記基因和目的進行PCR擴增。部分GUS陽性再生植株 (8株) 的擴增產物的電泳結果如圖5B、圖5C所示。在以GUS陽性植株的基因組DNA和載體質粒為模板，以基因特異引物進行擴增時，GUS陽性植株均獲得1條與預期結果大小一致的片段 (749 bp)，而非轉化 (野生型) 植株未擴增出特異條帶 (圖5B)；在對基因進行擴增時，GUS陽性植株皆得到1條與質粒作模板擴增條帶大小相同的條帶，而非轉化植株基因組做模板也未獲得擴增產物 (圖5C)。其余15株GUS陽性再生植株的PCR擴增結果與此相同 (未列出) 。上述檢測結果證明，外源目的基因已成功整合到紅陽獼猴桃GUS陽性植株的基因組上。

圖4 轉基因‘紅陽’獼猴桃的GUS組織化學染色

圖5 轉基因植株PCR檢測NPTⅡ、LJAMP2基因結果

本試驗共轉化葉盤450個，出芽率在85%以上，Kan芽生根率達100%。共獲得Kan植株40株，Kan植株獲得率為8.89%；經GUS染色和PCR檢測，40株Kan植株中23株呈陽性，陽性植株獲得率為57.50%。整體轉化頻率達5.11%。

3 討論

3.1 關于‘紅陽’獼猴桃的遺傳轉化條件

農桿菌介導的遺傳轉化是農桿菌與植物組織共同作用的復雜過程，凡涉及到農桿菌活性和受體細胞生理狀態(tài)的所有因素都可能影響到轉化效果。

3.1.1 Kan選擇壓與葉盤預培養(yǎng)時間

在植物遺傳轉化中，需要根據篩選標記基因的性質，選擇合適的抗生素來篩選抗性芽。而濃度過低，會產生假陽性抗性芽和大量嵌合體；濃度過高，會延緩抗性芽分化，甚至造成外植體褐化、死亡。

Kan能抑制細胞中核糖體蛋白質的合成，一定濃度時抑制細胞生長。在本試驗中，適宜的Kan選擇壓為25 mg/L。這與郭衛(wèi)東等的研究結果一致，而與Honda等(50 mg/L)和Han等(150 mg/L) 的不一致。主要原因是不同品種因基因型不同，耐Kan能力存在差異。

侵染前對外植體進行預培養(yǎng)，可以促進細胞分裂，因而更易整合外源DNA，從而提高轉化率。在本試驗中，葉盤預培養(yǎng)的適宜時間為3 d。這與郭衛(wèi)東等的研究結果一致，而與Wang等 (4周)相差較大。主要原因可能是葉盤在侵染前生理差異太大。

3.1.2 農桿菌侵染與共培養(yǎng)時間

農桿菌侵染和共培養(yǎng)時間是整個遺傳轉化中最重要的2個因素，因為農桿菌的附著、T-DNA的轉移和整合都在這個時期完成。時間太短，不能完成轉化；時間太長，篩選時難以脫菌，甚至由于農桿菌的毒害和選擇壓力的存在造成外植體褐化、死亡。農桿菌侵染時間一般不超過30 min，共培養(yǎng)時間一般應長于16 h。

在本試驗中，農桿菌侵染的最佳時間為10 min。這與郭衛(wèi)東等的研究結果一致，而與宋喜貴等 (15 min)和苑平等 (30 min)不一致。

尚霄麗等認為，不同品種的獼猴桃共培養(yǎng)時間不同，大多數以2?4 d轉化率較高。在已有報導中，共培養(yǎng)時間，有的為2 d，多數為3?4 d。在本試驗中，我們根據高月等的研究報道并結合實際預試結果，將共培養(yǎng)時間確定為2 d。

3.1.3 轉化過程中AS的作用

根癌農桿菌Ti質粒的Vir區(qū)對T-DNA的轉移起介導作用，而植物受傷細胞分泌的某些酚類化合物 (AS等) 對根癌農桿菌Vir基因的表達有誘導作用。因此，在菌液或共培養(yǎng)基中添加一定濃度AS，通?？商岣咿D化率。本試驗在共培養(yǎng)基中添加0.1 mmol/L AS后，轉化率提高。這與苑平等的研究結果一致，而與尚霄麗等 (0.2 mmol/L)不一致。這可能與不同品種葉盤的生理狀態(tài)，尤其與自身AS含量有關 (本試驗和部分此列文獻中侵染菌液含AS)。

3.1.4 菌液濃度與抗生素抑菌濃度

菌液濃度對轉化頻率的影響同侵染與共培養(yǎng)時間相同。一般認為適宜的菌液濃度=0.5左右。在已有報導中，菌液濃度 (值) 有的為0.5，有的0.6，個別較低 (0.3)，個別很高 (1?1.5)。本試驗根據高月等的報道，結合實際預試結果，把菌液濃度確定為=0.5。

抗生素抑菌濃度主要與農桿菌對所用抗生素的敏感性、菌液濃度和共培養(yǎng)時間有關。在本試驗中，通過不同濃度Carb和Cef的比較試驗，結果在Kn芽的篩選過程中，除菌效果Carb明顯優(yōu)于Cef，其最適濃度為400 mg/L。

顯然，不同農桿菌菌株的侵染能力、轉化時菌株的活化狀態(tài)、植物受體的生理狀態(tài)和對抗生素的耐受性都不盡相同，即使菌液濃度和侵染時間相同，同品種獼猴桃在不同試驗中轉化率也會存在差異。因此，在特定品種的遺傳轉化中，在確定所用菌株和抗生素后，只有努力造就菌株和受體良好的生理狀態(tài)，同時采用適宜的菌液濃度、侵染與共培養(yǎng)時間以及抗生素濃度，才能獲得較高的轉化率。

目前，在獼猴桃遺傳轉化中，Kan芽得率一般在4%左右。本試驗Kan芽得率雖然較高 (8.89%)，但與其葉盤直接再生頻率 (100%) 相差甚遠，而且整體轉化頻率 (5.11%) 也還不高。因此，本試驗中的遺傳轉化條件還需優(yōu)化，尤其是菌液濃度、共培養(yǎng)時間等因素的使用水平還應進一步篩選。

3.2 關于獼猴桃的潰瘍病和基因工程育種

作物病害是農業(yè)生產中的突出問題，其損失占糧食總產量的10%?15%，而植物病原菌突變頻率上升和抗藥性增強是病害大發(fā)的根本原因。潰瘍病是獼猴桃栽培中最具毀滅性的病害，由細菌類的丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種 (pv.) 引起，其適生范圍廣、發(fā)生迅猛、致病性強、難以根除，可在短期內造成大面積樹體死亡。潰瘍病現(xiàn)已在我國四川、陜西、安徽、湖南和福建等省的獼猴桃栽培區(qū)域發(fā)生，是獼猴桃生產面臨的重大問題。

抗菌肽也稱抗菌蛋白 (Antimicrobial proteins，AMPs)。在植物抗病基因工程中，AMPs顯示出明顯優(yōu)勢。AMPs廣泛存在于動植物和微生物中，主要作用于細胞膜而實現(xiàn)廣譜殺菌作用。近年來，人們將不同來源的抗菌肽導入植物，獲得了一些抗病轉基因植株。

本試驗針對獼猴桃栽培中的突出問題，在國內外首次利用抗?jié)儾〉腁MPs基因轉化紅陽獼猴桃，在國內率先開展獼猴桃抗病基因的遺傳轉化，并獲得了經GUS組織染色和PCR鑒定的轉基因植株，這將有助于紅陽獼猴桃的基因工程研究，從而促進獼猴桃的產業(yè)發(fā)展。當然，本試驗所獲得的轉基因植株還需通過Southern等分子雜交和RT-PCR等目的基因的表達分析以進一步驗證其可靠性。構建雙價或多價轉化載體，同時將抗病、耐貯基因導入紅陽獼猴桃，以期培育出既抗病又耐貯的獼猴桃新品種，應當是今后我國獼猴桃基因工程育種的主攻方向。

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(本文責編 陳宏宇)

-mediated transformation ofgene into ‘Red Sun’ kiwifruit and its molecular identification

Yue Zhou, Xupeng Zhao, Xiuhua Wu, Yanling Zhang, Lin Zhang, Keming Luo, and Shaohu Tang

1 Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Southwest University, Chongqing 400715, China 2 School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

Bacterial canker caused bypv.is one of the most important diseases of kiwifruit () and leads to considerable yield losses. In order to obtain transgenic plants with resistance for ‘Red Sun’ kiwifruit to canker disease, a non-specific lipid transfer protein-like antimicrobial protein gene () from motherwort () was introduced into ‘Red Sun’kiwifruit through-mediated transformation. After two days of co-cultivation withstrain LBA4404 harboring:the transformed explants were transferred to the selection medium containing 25 mg/Lkanamycin+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA. The regeneration efficiency of kanamycin-resistant shoots reached to 85%. All (100%) of kanamycin-resistant shoots rooted on half-strength MS medium supplemented with 0.8 mg/L IBA and a total of 40 regenerated plantlets were obtained. PCR and histochemical GUS activity analysis show that 23 of 40 lines (57.50%) were positive, suggesting that thegene was integrated into the genome of ‘Red Sun’kiwifruit. Taken together, we established an efficient genetic transformation method for ‘Red Sun’ kiwifruit usings and the transformation frequency reached 5.11%. This protocol will be useful for the genetic breeding of ‘Red Sun’ kiwifruit for improvement of disease resistance.

‘Red Sun’kiwifruit (), canker disease,gene, genetic transformation,

September 13, 2013; Accepted:December 6, 2013

National Natural Science Foundation of China (No. 30871576).

Shaohu Tang. Tel:+86-23-68252838; E-mail: tangsh@swu.edu.cn

國家自然科學基金(No. 30871576) 資助。

網絡出版時間：2014-02-12

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130479.html