程俊文，賀亮*，李肖娟，胡傳久，魏海龍，付立忠，李海波

(1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310023；2.杭州雪域生物技術(shù)有限公司)

靈芝(Ganodermalucidum)是一種藥用價(jià)值很高的名貴真菌，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已證實(shí)：靈芝對(duì)多種疾病尤其是癌癥、心臟病、腦血栓等嚴(yán)重威脅人類生命的疾病具有十分顯著的療效[1]。近年來，隨著人們生活水平和保健意識(shí)的提高以及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)的拓展，僅靠野外采集或人工栽培子實(shí)體已不能滿足人們對(duì)靈芝的需求，因而利用液體深層發(fā)酵技術(shù)大量而且快速地生產(chǎn)靈芝發(fā)酵產(chǎn)物的方法得到了普遍應(yīng)用[2]。

響應(yīng)曲面法(response surface methodogy，RSM)是建立一個(gè)包括各因素的一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和任何兩個(gè)因素之間的一級(jí)交互作用項(xiàng)的數(shù)學(xué)模型。近年來日益受到重視, 該方法采用可以建立連續(xù)變量曲面模型，對(duì)影響生物產(chǎn)量的因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，從而快速有效地確定生物過程的最佳條件。目前該方法現(xiàn)已廣泛用于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化和酶解等生化反應(yīng)優(yōu)化和模型建立中[3-4]。本實(shí)驗(yàn)以靈芝胞外多糖為目標(biāo)產(chǎn)物，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成來提高靈芝液體發(fā)酵胞外多糖的產(chǎn)量，為以后的發(fā)酵和放大實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

靈芝(Ganodermalucidum)：由浙江省林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面PDA活化菌種用。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基。馬鈴薯100g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/ L。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖20g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)。從母種試管中切出蠶豆大小的菌絲塊接種于斜面的中部，在25℃培養(yǎng)7d。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)將活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種于液體培養(yǎng)基中，500mL 三角瓶裝培養(yǎng)基150mL于25℃，150r/min培養(yǎng)7d。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)。采用二級(jí)搖瓶，500mL三角瓶裝液量150mL，液體菌種接種量為10%，于25℃，150r/min培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、小麥粉取代搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，分別進(jìn)行碳源種類試驗(yàn)；以酵母粉、蛋白胨、豆餅粉、麥麩、牛肉浸膏取代酵母粉，分別進(jìn)行氮源種類試驗(yàn)；以10～30g/L葡萄糖進(jìn)行碳源濃度梯度試驗(yàn)，以2～16g/L的酵母粉進(jìn)行氮源濃度梯度試驗(yàn)。

1.4.2 響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇葡萄糖、玉米粉、豆餅粉3個(gè)因素所確定的水平范圍，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[5]，采用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，利用DesignExpert8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。自變量的試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表

1.5 分析方法

1.5.1 菌絲干重測(cè)定

取100mL發(fā)酵液，在3000r/min離心20min，經(jīng)自來水洗滌多次后，將菌絲體在105℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.5.2 胞外多糖(extracellular polysaccharides，簡(jiǎn)寫EPS)的測(cè)定

收集發(fā)酵液，3000r/ min離心20min，取上清液，濃縮，加入3倍體積的95%酒精，4℃冰箱醇沉24h，4000r/min離心20min得沉淀物，用硫酸-苯酚法測(cè)定其多糖的含量[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 不同碳源對(duì)靈芝液體發(fā)酵胞外多糖的影響

表3 起始碳源濃度對(duì)菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響

表4 不同氮源對(duì)靈芝液體發(fā)酵胞外多糖的影響

表5 起始氮源濃度對(duì)菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響

表2～表5的結(jié)果說明：葡萄糖、玉米粉和小麥粉都是較好的碳源，其含量對(duì)靈芝胞外多糖的積累隨著濃度的增加而增大，繼續(xù)增大則趨于平穩(wěn)；從生產(chǎn)實(shí)際考慮，選擇葡萄糖和玉米粉作為靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基的復(fù)合碳源。酵母粉和豆餅粉都是較好的氮源，其含量對(duì)多糖的積累隨著濃度的增大而增大，繼續(xù)增到一定值反而降低；從生產(chǎn)實(shí)際考慮，豆餅粉價(jià)格低廉，容易獲得，因此選擇豆餅粉作為靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)試驗(yàn)用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。以胞外多糖得率為響應(yīng)值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

利用Design Expert 8.05軟件對(duì)表6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[7]，獲得靈芝胞外多糖得率對(duì)葡萄糖、玉米粉和豆餅粉的多元二次回歸方程：EPS(mg·L-1)=341.36+4.81X1+8.61X2+22.55X3-6.95X1X2+12.28X1X3-9.36X2X3-37.26X1X1-19.97X2X2-19.96X3X3

表7 回歸模型方差分析

由表7方差分析可知，以胞外多糖含量為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果達(dá)到極顯著水平，P值均<0.0001；模型的決定系數(shù)R2=0.9879，說明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好；校正決定系數(shù)AdjR2=0.9724，說明該模型能解釋97.24%響應(yīng)值的變化；模型的失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率，表7中模型失擬項(xiàng)的P值為0.0956，大于0.05，表明模型的失擬項(xiàng)不顯著；根據(jù)表7的顯著性分析結(jié)果，各因素的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)以及X1X2、X1X3、X2X3的交互項(xiàng)對(duì)胞外多糖的合成均顯著(P<0.05)影響；綜合以上表明這個(gè)模型建立的回歸方程能運(yùn)用于靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測(cè)。

2.2.3 響應(yīng)面圖形分析

分別將模型中的葡萄糖、玉米粉及豆餅粉的其中一個(gè)因素固定在0水平，得到另外兩個(gè)因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖1～3所示，各個(gè)因素及其相互間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響靈芝發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖最顯著的因素為葡萄糖(X1)，表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。玉米粉(X2)和豆餅粉(X3)響應(yīng)面弧度變化平緩，說明對(duì)響應(yīng)值影響相對(duì)較小。此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖1～圖3可以看出，X1與X3交互作用顯著；X2與X3，X1與X2均無交互作用，表明一因素對(duì)響應(yīng)值的影響規(guī)律并不會(huì)隨著另一因素的改變而有明顯變化。

圖1 葡萄糖和玉米粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖

圖2 葡萄糖和豆餅粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖

圖3 玉米粉和豆餅粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過SAS軟件對(duì)上述方程進(jìn)行求解，得到最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖15.79g/L，玉米粉10.23g/L，豆餅粉10.41 g/L，胞外多糖產(chǎn)量理論值可達(dá)348.75mg/L。

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)值與實(shí)際實(shí)驗(yàn)值之間的相關(guān)性，即檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對(duì)靈芝在預(yù)測(cè)的最優(yōu)發(fā)酵條件下胞外多糖產(chǎn)量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中葡萄糖、玉米粉和豆餅粉的優(yōu)化值分別為15.79、10.23、10.41g/L，三組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得胞外多糖產(chǎn)量分別為338.79mg/L、341.04mg/L、340.32mg/L，實(shí)際胞外多糖平均值為340.05mg/L，達(dá)到了回歸模型預(yù)測(cè)理論值的97.5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)靈芝胞外多糖產(chǎn)量。

3 結(jié)論

考察了不同碳、氮源營養(yǎng)因子的影響，結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)踐，選擇葡萄糖和玉米粉為碳源，豆餅粉為氮源，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及三因素三水平的響應(yīng)面分析，通過二次多項(xiàng)回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸擬合，預(yù)測(cè)了靈芝產(chǎn)胞外多糖最佳培養(yǎng)基條件為：葡萄糖15.79g/L，玉米粉10.23g/L，豆餅粉10.41g/L，胞外多糖產(chǎn)量理論值可達(dá)348.75mg/L。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中胞外多糖可得340.05mg/L，與預(yù)測(cè)值十分接近，證明了該實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性。

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