徐 梅 張 蓓 尹鳳玲 成 杰 劉 洋 李 丹 蔣敬庭 吳昌平

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，其組織類型繁多，約85%～90%為上皮性卵巢癌。隨著免疫細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，免疫治療(特別是細胞過繼性免疫治療)已成為繼腫瘤患者手術(shù)、化療、放療后輔助治療的重要手段之一[1]。本研究目的是探討CIK細胞是否增強化療藥順鉑DDP對卵巢癌細胞株SKOV-3的殺傷活性，為卵巢癌綜合治療新策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

①淋巴細胞分離液(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所)；②COBE spectra 型血細胞分離機(Gambro BC公司)；③流式細胞分析儀EPICS XL(美國貝克曼庫爾特公司)；④鼠抗人CD3McAb(美國Antihody Diagnostica Inc公司)；⑤基因重組人IL-2(山東泉港藥業(yè)有限公司)；⑥重組人IFN-γ(上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司)；⑦重組人IL-1α(美國Pepro Tech EC Ltd公司)；⑧鼠抗人CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三標(biāo)記抗體，CD3-FITC/CD16CD56-PE雙標(biāo)記抗體，同型對照IgG1FITC/IgG1PE/IgG1PE-Cy5IgG1FITC/IgG1PE，IgG1

-PE，IgG1-PC5：(美國Beckman Coulter公司，蘇醫(yī)生物基因公司)；⑨ANNEXIN V-FITC凋亡檢測試劑盒(碧云天生物公司)；⑩順鉑注射液(批號：130302 江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 效應(yīng)CIK細胞的制備和免疫表型分析[2]

用淋巴細胞分離液密度離心提取O型健康者單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2×106/ml，第1天加入IFN-γ(1.5×106U/L)，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后加入CD3 McAb (100 μg/L)、IL-2(5.0×105U/L )和IL-1α(1.0×105U/L)，以后每2～3天添加一次培養(yǎng)液，同時補加IL-2(5.0×105U/L)，于培養(yǎng)第1、7、14天收取CIK細胞，分別加入抗CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三標(biāo)抗體和抗CD3-FITC/CD56-PE雙標(biāo)抗體混勻，4℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測CIK細胞表型變化，測定CD3+CD56+雙陽性細胞百分比。

1.3 卵巢癌細胞株的培養(yǎng)

SKOV-3細胞株購自上海中國科學(xué)院細胞庫，凍存于-196℃液氮中，由我院中心實驗室傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)于改良RPMI-1640完全培養(yǎng)基。

1.4 流式細胞儀檢測CIK培養(yǎng)上清液對SKOV-3細胞的凋亡作用

選取培養(yǎng)l4天的CIK細胞，更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，1 500r/min，離心5 min，留取CIK細胞培養(yǎng)的上清液，以1∶1的比例混合新鮮改良RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV-3細胞，培養(yǎng)24 h、48 h收集細胞，以未加CIK培養(yǎng)液上清的SKOV-3細胞作為對照組。按照Annexin V-FITC試劑盒說明結(jié)合流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.5 MTT法測定CIK細胞和DDP對SKOV-3細胞的殺傷效應(yīng)

取培養(yǎng)第14天收獲的CIK細胞作為效應(yīng)細胞，對數(shù)生長期的SKOV-3細胞作為靶細胞。調(diào)整靶細胞濃度為1.0×105/ml，加入96孔平底培養(yǎng)板，100 μl/孔。次日細胞貼壁后按不同組別給予相應(yīng)處理：A1～4CIK作用組，按效靶比不同(A1組5∶1、A2組10∶1、A3組20∶1、A4組40∶1)加入不同濃度的CIK細胞100 μl；B1～7DDP作用組分別加入用完全培養(yǎng)基配制的不同濃度DDP100 μl (其作用濃度分別為：B1組0.625、B2組1.25、B3組2.5、B4組5、B5組10、B6組20、B7組40 μg/ml)；C1～2CIK聯(lián)合DDP作用組先給予DDP(濃度2.5 μg/ml)作用4 h后，分別按效靶比為5∶1和10∶1加入不同濃度CIK細胞。同時設(shè)單獨靶細胞及不同濃度效應(yīng)細胞做對照孔，每組設(shè)6個復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2孵箱中分別于培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加MTT 20 μl (5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，平板離心機1 500 r/min離心10 min，小心棄去上清液，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μl，輕輕振蕩10 min以溶解形成的色素顆粒，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測λ=492 nm波長處的吸光度(A值)。按下列公式計算抑制率：抑制率 (%)=[1-(實驗孔A值-效應(yīng)細胞A值)/靶細胞A值]×100%或抑制率(%)= (1-實驗孔A值/靶細胞A值)×100%

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CIK細胞表型分析和擴增[2]

CD3+CD56+雙陽性CIK細胞在第1、7、14天所占比例分別為(0.7±0.4)%、(11.5±0.9)%及(31.6±5.5)%。隨著培養(yǎng)時間延長，CD3+CD56+雙陽性CIK細胞表達的比例逐漸增加，本實驗選用培養(yǎng)第14天的CIK細胞，流式細胞儀檢測其CD3+CD56+細胞比例達38.7%，見圖1。說明CIK細胞可通過體外培養(yǎng)獲得大量增殖。

圖1 培養(yǎng)第14天CD3+CD56+CIK細胞表型變化

2.2 流式細胞儀檢測CIK培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)SKOV-3細胞凋亡情況

Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色后，正常的活細胞不會被染色(FITC-/PI-，圖2左下象限)，凋亡早期的細胞僅被Annexin V-FITC染色(FITC+/PI-，圖2右下象限)，凋亡晚期和壞死細胞會被Annexin V-FITC和PI雙染(FITC+/ PI+，圖2右上象限)。本實驗組24 h 及48 h凋亡率分別為(12.63±0.95)%和(27.13±2.03)%，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表明在一定時間內(nèi)，隨著作用時間的延長凋亡率不斷增高。

圖2 SKOV-3細胞與CIK培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)后凋亡情況

2.3 MTT法檢測不同因素對SKOV-3生長抑制情況見

在相同作用時間時，CIK、DDP及其聯(lián)合治療各小組間抑制率存在顯著性差異(P<0.05)，除DDP 0.625 μg/ml組24 h和48 h抑制率差異無顯著性(P=0.102)，其余各組不同時間抑制率存在顯著性差異 (P<0.05)，隨著作用時間延長，其細胞抑制作用明顯增強。聯(lián)合用藥組與單一因素處理組組間比較差異存在顯著性 (P<0.05)。見表1。

3 討論

CIK細胞是由Schmidt Wolf等在1991年首先報道。其是將人外周血單個核細胞(PBMC)在體外經(jīng)多種細胞因子(如抗CD3McAb、IL-2、γ-IFN等)共培養(yǎng)后獲得的一群異質(zhì)細胞群。CD3+CD56+細胞是CIK細胞中的主要效應(yīng)細胞，既有T淋巴細胞強大的抑瘤活性，又具有NK細胞非MHC限制性殺瘤優(yōu)點，故又稱為NK細胞樣T淋巴細胞[3-4]。CIK細胞與LAK細胞、CD3AK細胞相比具有增殖快、殺瘤活性高及對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感的特點[5]，被認為是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方法。CIK治療已被應(yīng)用于腫瘤患者的臨床治療(如白血病[6]、胃癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]等)并取得較好的殺瘤效果。

研究結(jié)果[2]顯示，起初CD3+CD56+細胞比例為(0.7±0.4)%，第14、21天分別增為(31.6±5.5)%

表1 CIK或(聯(lián)合)DDP對SKOV-3細胞的殺傷作用

注：①A1～4CIK治療組：CIK與SKOV-3效靶比依次為5∶1、10∶1、20∶1、和40∶1；②B1～7DDP治療組：DDP濃度依次為0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μg/ml；③C1～2聯(lián)合治療組：DDP濃度均為2.5 μg/ml，CIK與SKOV-3效靶比分別為5∶1和10∶1。

和(35.8±9.7)%，擴增倍數(shù)可達35～52倍。動態(tài)分析其表型特征發(fā)現(xiàn)，第14～21天為CD3+CD56+細胞高表達的平臺期，在此期間可獲得較為理想的效應(yīng)細胞，進一步臨床研究發(fā)現(xiàn)，增加CIK細胞輸注的頻次可明顯降低胃癌患者的死亡風(fēng)險[7]。本實驗選擇體

外培養(yǎng)14天的CIK細胞，流式細胞檢測其CD3+CD56+細胞所占比例達到38.7%。殺傷實驗結(jié)果顯示，當(dāng)效靶比為5∶1時，24 h和48 h的殺傷率分別為(16.52±2.52)%和(24.20±5.59)%。當(dāng)效靶比增為40∶1時，其24 h和48 h的殺傷率分別為(53.98±5.02)%和(74.74±6.87)%，說明CIK細胞對SKOV-3卵巢癌細胞具有較強的殺傷作用，并且，隨著效靶比增加及作用時間延長，其細胞毒性明顯增強。順鉑是卵巢癌經(jīng)典的一線化療藥物，本研究中，當(dāng)順鉑濃度為2.5 μg/ml時，48 h對SKOV-3的抑制率為(46.04±2.76)%，聯(lián)合5∶1和10∶1 CIK細胞共培養(yǎng)48 h后細胞抑制率分別為(69.87±2.67)%和(80.11±2.73)%。這說明隨著CIK細胞濃度的增加及作用時間的延長，細胞抑制率明顯增高。常規(guī)化療聯(lián)合CIK治療具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

CIK細胞對腫瘤細胞發(fā)揮殺傷作用的機制可能有以下幾點：①與靶細胞結(jié)合并釋放穿孔素及顆粒酶對靶細胞發(fā)揮殺傷作用。②產(chǎn)生大量細胞因子(如γ-IFN，TNF-α，IL-2等)作用于腫瘤細胞。③調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮間接殺傷作用。研究[10]發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者在經(jīng)過CIK細胞治療后，其外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細胞(Treg)比例較治療前明顯降低，說明CIK治療可以在一定程度上提高患者的免疫功能。④誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和壞死。Shan等[11]用Curcumin可提高靶細胞及CIK細胞表面Fas-FasL蛋白的表達而發(fā)揮促進凋亡作用。另有研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，CIK細胞是通過下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2或上調(diào)促凋亡基因Bax蛋白表達來誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。本實驗采用CIK培養(yǎng)液上清和SKOV-3細胞共培養(yǎng)，隨后24 h和48 h凋亡檢測結(jié)果顯示細胞凋亡和壞死率逐漸增加，說明CIK可產(chǎn)生殺傷因子并通過誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細胞凋亡而發(fā)揮殺傷作用。

卵巢癌位于盆腔，其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有局限于腹腔內(nèi)的特點，自體CIK 細胞無免疫源性，應(yīng)該比較適合于腹腔灌注治療。CIK治療可為無法手術(shù)又難以耐受放化療的晚期卵巢癌患者提供治療策略。對延長此類患者生存期、改善其生存質(zhì)量，具有非常重要的意義。

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