許淑芬 王英凱 劉 磊 孫牧男 馬寅芙 方艷秋 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院中心實驗室，吉林 長春 130021)

胰島素生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-2與大腦發(fā)育有關(guān)〔1〕。腦中IGFBP-2在一些急、慢性非生理狀態(tài)下會升高，如外傷、缺氧、細胞再生等，升高的IGFBP-2來源于活化的星形細胞及微膠質(zhì)細胞。Sallinen等〔2〕發(fā)現(xiàn)，高度惡性的膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)中IGFBP-2高表達，其表達越高，愈后越差。Elmlinger等〔3〕發(fā)現(xiàn),大量表達IGFBP-2的細胞常聚集于腫瘤壞死灶附近。Muller等〔4〕發(fā)現(xiàn),中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病人腦脊液IGFBP-2顯著升高。提示IGFBP-2可能作為膠質(zhì)瘤的診斷指標和治療靶點。RNA干擾(RNAi)是真核生物中存在的一種抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達的監(jiān)控機制，具有重要生物學和臨床意義。本研究擬構(gòu)建針對IGFBP-2的siRNA表達載體，通過RNAi技術(shù)實現(xiàn)IGFBP-2基因沉默，為腦膠瘤基因治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料 膠質(zhì)瘤U251細胞株、大腸桿菌DH5α、pSilencer 2.1-U6 neo載體本室保存； Trizol Reagent、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV Reverse transcriptase為Promega公司產(chǎn)品；Taq DNA polymerase、T4 DNA ligase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ均為Takara公司產(chǎn)品, 胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；單克隆抗體及二抗購自北京晶美公司；引物由賽百盛公司合成。

1.2IGFBP-2 siRNA、IGFBP-2、β-actin引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中報道的IGFBP-2核苷酸序列(NM-000597)，參考siRNA及引物的設(shè)計原則，利用Ambion公司siRNA在線設(shè)計軟件，從IGFBP-2核苷酸序列起始密碼子下游尋找符合設(shè)計特征的靶序列，篩選得到576～594 nt、908～926 nt、938～956 nt 3個19 bp片段為靶序列，設(shè)計的siRNA序列5'端和3'端分別引入BamHⅠ、HindⅢ兩個酶切位點，加入9 bp的loop環(huán)結(jié)構(gòu)，3'末端加轉(zhuǎn)錄終止信號TTTTTT。采用國際通用的與所有基因均無同源性的序列siRNA為陰性對照，見表1。經(jīng)BlastSearch檢索確認與IGFBP-2以外的人類已知基因序列無同源性。

1.3寡核苷酸退火 將合成的IGFBP-2及陰性對照siRNA寡核苷酸分別溶解在50 μl無核酸酶的水中，后各取2 μl加入6 μl 10×退火緩沖液。90℃孵育3 min，緩慢降溫，37℃孵育1 h，然后緩慢冷卻至4℃；2%瓊脂糖電泳。

1.4重組表達載體的構(gòu)建及鑒定 pSilencer 2.1-U6經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切線性化。取2 μl上述各組退火產(chǎn)物， 1 μl雙酶切后線性化的pSilencer 2.1-U6載體，1 μl 10×T4連接酶緩沖液、1 μl T4 DNA連接酶，5 μl無核酸酶去離子水，建立連接反應(yīng)，16℃過夜連接。次日分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌，轉(zhuǎn)化菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)板中，37℃過夜。提取質(zhì)粒，酶切、測序鑒定,篩選出陽性克隆。

1.5重組表達載體的轉(zhuǎn)染及篩選 取對數(shù)生長期的U251細胞接種于6孔板，密度達80%時，用IipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6 h以后更換含20%FBS培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。G418篩選，收集G418抗性細胞。

1.6RT-PCR檢測IGFBP-2 mRNA的表達 參照Invitrogen公司說明，使用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，選擇β-actin作為內(nèi)參照。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃45 s、55℃45 s、72℃45 s，30個循環(huán)后再72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果。

1.7Western印跡分析IGFBP-2 蛋白的表達 收集各組細胞，加入細胞裂解液，蛋白變性，測定蛋白的含量。取適量樣品進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；用半干式轉(zhuǎn)移電泳儀電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜3 h , 3 %BSA 封閉液4℃過夜, 1×PBS 洗膜,加入鼠抗人IGFBP-2 單抗(1∶500) , 37℃結(jié)合2 h , 洗膜, 加入馬抗小鼠IgG (1∶500) , 37℃結(jié)合2 h , 洗膜, 充分洗滌顯色，化學發(fā)光儀檢測PVDF膜上IGFBP-2蛋白的表達。

表1 針對IGFBP-2基因設(shè)計的寡核苷酸序列

2 結(jié) 果

2.1重組載體測序及酶切鑒定 重組載體測序結(jié)果證實IGFBP-2 siRNA成功構(gòu)建于pSilencer 2.1-U6載體上，與目的序列相同。將重組質(zhì)粒pSilencer 2.1-IGFBP-1、pSilencer 2.1-IGFBP-2、pSilencer 2.1-IGFBP-3、pSilencer 2.1-IGFBP-NC經(jīng)BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切產(chǎn)生約65 bp 大小的目的片段。見圖1。

2.2RT-PCR檢測IGFBP-2 mRNA的表達 轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-1(0.229±0.018 1)、pSilencer 2.1-IGFBP-2(0.008±0.005 1)、pSilencer 2.1-IGFBP-3(0.173±0.035 1)的U251膠質(zhì)瘤細胞與3個對照組相比IGFBP-2 mRNA表達明顯降低(P<0.01)，且pSilencer 2.1-IGFBP-2的沉默抑制作用強于pSilencer 2.1-IGFBP-1和pSilencer 2.1-IGFBP-3，幾乎完全抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而3個對照組〔(無關(guān)siRNA對照組(0.476±0.044 2)、空載體對照組(0.494±0.065 2)和U251細胞對照組(0.418±0.045 2)〕細胞中都存在較高水平的IGFBP-2 mRNA表達。見圖2。

M:DNA 標準 DL2000+15000;1:無關(guān) siRNA 退火產(chǎn)物;2:pSilencer 2.1-IGFBP-1雙酶切;3:pSilencer 2.1-IGFBP-2雙酶切;4:pSilencer 2.1-IGFBP-3雙酶切;5:pSilencer 2.1-IGFBP-3雙酶切

M:DNA 標準 DL2000+15000;1:U251細胞； 2:轉(zhuǎn)染 pSilencer 2.1-IGFBP-NC； 3:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-U6； 4:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-1； 5:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-2;6:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-3

1:U251細胞； 2:轉(zhuǎn)染 pSilencer 2.1-IGFBP-NC； 3:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-U6； 4:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-1； 5:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-2;6:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-3

2.3Western印跡分析IGFBP-2 蛋白的表達 圖3可見，轉(zhuǎn)染實驗組細胞與3個對照組相比IGFBP-2蛋白表達明顯降低，且pSilencer 2.1-IGFBP-2的沉默抑制作用強于pSilencer 2.1-IGFBP-1、pSilencer 2.1-IGFBP-3，而3個對照組(無關(guān)siRNA對照組、空載體對照組和U251細胞對照組)細胞中都有較高水平的IGFBP-2蛋白表達。

3 討 論

IGFBP-2屬于胰島素樣生長因子家族，可通過IGF依賴和非依賴性作用發(fā)揮其生物學功能，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，具有調(diào)節(jié)細胞增生、促血管生成、促細胞遷移和促腫瘤侵襲性作用〔5～8〕。用基因表達微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)在人類進展期神經(jīng)膠質(zhì)瘤及成膠質(zhì)細胞瘤中，IGFBP-2基因表達異常升高，進一步的研究提示，IFBP-2基因高表達將有利于腫瘤的侵襲〔9〕。有作者發(fā)現(xiàn)，IGFBP-2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤SNB19細胞中的過度表達能增強腫瘤細胞的侵襲潛能，且造成腫瘤發(fā)展的部分原因是由于IGFBP-2的過度表達導致MMP-2的表達增加，促進了腫瘤的侵襲〔7〕。許多文獻證明 中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤血漿、組織ICFBP-2水平明顯上調(diào)〔10，11〕，且隨著IGFBP-2水平增高愈后不良〔12，13〕。因此提示IGFBP-2可能作為膠質(zhì)瘤的治療靶點，通過降低IGFBP-2水平抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長，促進其凋亡。

RNAi現(xiàn)象的特點：高度特異性，高沉默效率，高穿透性，只有針對編碼區(qū)的dsRNA序列才能產(chǎn)生有效特異性干擾，對內(nèi)含子和啟動子則不能產(chǎn)生〔5，6〕。目前制備siRNA的方法主要是體外合成和體內(nèi)表達。體外化學合成方法價格昂貴，抑制效果維持時間短。體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA以DNA寡核苷酸為模板，在體外轉(zhuǎn)錄合成,優(yōu)點是經(jīng)濟實惠，但是反應(yīng)規(guī)模受到限制，適合于篩選。使用質(zhì)粒DNA構(gòu)建的siRNA表達載體可在細胞內(nèi)長時間、穩(wěn)定地生成小干擾RNA，使哺乳動物細胞內(nèi)基因表達長期沉默成為可能〔14〕。本研究使用的pSilencer 2.1-U6 neo帶U6啟動子和一個有6個T的轉(zhuǎn)錄終止位點。將編碼IGFBP-2基因的特異序列(其RNA能形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu))插人載體U6啟動子的下游，轉(zhuǎn)入膠質(zhì)瘤U251細胞內(nèi)，載體從一個保守的A開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到連續(xù)的T即在轉(zhuǎn)錄終止位點的第2個堿基處終止轉(zhuǎn)錄，從而表達出shRNA，shRNA很快在細胞中被加工成為siRNA，隨后啟動RNAi過程。采用這種方法的優(yōu)點在于合成siRNA的過程轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)進行，排除了RNA酶的干擾，延長了siRNA的半衰期；同時由于載體可以復(fù)制和擴增，所以能夠顯著降低siRNA的成本；另外，利用該方法可以進行穩(wěn)定表達細胞株的篩選。隨著載體質(zhì)粒的復(fù)制擴增，RNAi可以擴散到整個機體，基因抑制效果可以傳代。本研究設(shè)計了能夠在細胞內(nèi)表達針對IGFBP-2基因的shRNA的質(zhì)粒并將其導人U251細胞。實驗結(jié)果表明，RNAi質(zhì)粒載體的導入明顯抑制了IGFBP-2 mRNA以及蛋白的表達。空質(zhì)粒組與空白對照組的結(jié)果差異無顯著性，排除了質(zhì)粒本身對基因的抑制作用。陰性對照組與空白對照組的結(jié)果差異亦無顯著性，說明了RNAi的高度特異性。本實驗成功構(gòu)建了靶向IGFBP-2基因的siRNA載體，并能有效抑制U251細胞中IGFBP-2 mRNA和蛋白的表達，其中以pSilencer-IGFBP-siRNA2的沉默效果最強，為進一步研究利用RNAi技術(shù)抑制腦膠質(zhì)瘤奠定了基礎(chǔ)。

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