徐文清 肖 戈 吳義高 黃 福 王 尉 胡衛(wèi)列

腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma)是發(fā)生于腎上腺皮質(zhì)的1種惡性程度高、預(yù)后差的惡性腫瘤[1]。臨床較為少見(jiàn)，發(fā)病率為1/200萬(wàn)人，初次就診即有40%發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率為低于30%[2]，因此臨床上很獲取新鮮的腎上腺皮質(zhì)癌標(biāo)本，同時(shí)觀察其發(fā)生及發(fā)展過(guò)程也存在困難。因此構(gòu)建腎上腺皮質(zhì)癌動(dòng)物模型顯的極為重要。本研究應(yīng)用人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13細(xì)胞接種裸鼠，建立了人腎上腺皮質(zhì)癌裸鼠移植瘤模型。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。胎牛血清、0.25%胰酶消化液購(gòu)于Hyclone公司，L-15細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)于杭州吉諾公司。實(shí)驗(yàn)用的20只BALB/C裸鼠由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，雌雄不限，鼠齡4～6周，體重20～25 g。飼養(yǎng)條件為SPF(specific-pathogen free)級(jí)?；\具、墊料、食料及飲用水均經(jīng)滅菌處理，按標(biāo)準(zhǔn)方式給予裸鼠自由活動(dòng)及進(jìn)食。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SW-13細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L-15細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，1～2天換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期時(shí)，用0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活力達(dá)90%以上。PBS洗3次，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107/ml備用。

1.3 細(xì)胞接種

將調(diào)整好的細(xì)胞濃度為3×107/ ml的SW-13細(xì)胞共5 ml，以1 ml注射器抽取細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種0.2 ml，即接種細(xì)胞數(shù)量為6×106個(gè)，接種部位為裸鼠左側(cè)腋下，每次注射后均勻抽取0.2 ml PBS再次注射以保證腫瘤細(xì)胞全部注入裸鼠皮下，接種前碘伏消毒皮膚，共接種20只裸鼠。

1.4 移植瘤觀察

接種5天后逐日觀察接種部位，以了解腫瘤生長(zhǎng)潛伏期和生長(zhǎng)速度，同時(shí)大體觀察移植瘤的形態(tài)、體積、顏色以及與周?chē)M織的關(guān)系，移植瘤成瘤潛伏期為接種日至長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)腫瘤的時(shí)間(d)。成瘤后每4天1次測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)及短徑(b)，按公式V=1/6(πab2)計(jì)算腫瘤體積，共觀察10周，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線圖。成瘤百分率(%)=接種成功只數(shù)/接種總數(shù)×100%。

1.5 組織病理學(xué)檢查

接種后第10周處死裸鼠，手術(shù)剝離腫瘤，先對(duì)腫瘤行大體觀察，然后用10%福爾馬林液固定，石蠟包埋切片HE染色，并于顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 SW-13細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

SW-13細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L-15細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3天后于倒置相差顯微鏡下觀察，可見(jiàn)SW-13細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，主要呈多角形或不規(guī)則形。

2.2 移植瘤生長(zhǎng)特性

裸鼠在接種SW-13細(xì)胞后生長(zhǎng)情況良好。平均接種(18±1.2)d后，19只裸鼠在接種部位均可見(jiàn)腫瘤硬塊，據(jù)此推算平均成瘤潛伏期為18 d，成瘤百分率為95%(19/20)，此后腫瘤生長(zhǎng)速度加快，腫瘤體積倍增時(shí)間約(10±1.8)d，平均于接種后(60±1.5)d，腫瘤最大徑達(dá)20 mm，此后腫瘤生長(zhǎng)速度減慢(圖1)。移植瘤外觀上凸出于皮面，多為橢圓形，表面多呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)地偏韌，移動(dòng)度可，皮膚無(wú)破潰及紅腫。手術(shù)摘除后，19例腫瘤包膜均完整，未見(jiàn)向肌肉侵襲生長(zhǎng)現(xiàn)象，切面呈魚(yú)肉樣，中間可見(jiàn)部分壞死灶。

2.3 移植瘤病理學(xué)特征

HE染色結(jié)果顯示，腫瘤呈彌漫性分布，細(xì)胞核大小不一，核分裂指數(shù)≥5 / 50 HP，并可見(jiàn)不典型核分裂，根據(jù)weiss標(biāo)準(zhǔn)可初步診斷為腎上腺皮質(zhì)癌。

圖1 腫瘤生長(zhǎng)曲線

3 討論

在實(shí)驗(yàn)研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究是從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究向臨床實(shí)驗(yàn)研究的一個(gè)重要過(guò)渡，而建立動(dòng)物模型是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。本研究采用人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13細(xì)胞成功建立了人腎上腺皮質(zhì)癌裸鼠移植瘤模型，并對(duì)移植瘤部分生長(zhǎng)特性進(jìn)行觀察，并對(duì)其進(jìn)行病理學(xué)鑒定，該模型為研究腎上腺皮質(zhì)癌的發(fā)病機(jī)制及診治方法提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

建立動(dòng)物腫瘤模型方法包括腫瘤細(xì)胞接種法、腫瘤組織塊接種法以及藥物誘導(dǎo)等不同方法。腫瘤細(xì)胞接種法是采用腫瘤細(xì)胞懸液注入動(dòng)物體內(nèi)從而建立腫瘤模型的方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、無(wú)需特殊處理等優(yōu)點(diǎn)，且移植成功率較高，應(yīng)用較為廣泛。本研究采用腫瘤細(xì)胞接種法，移植成功率為95%(19/20)，其中1只裸鼠未能成瘤考慮于操作不當(dāng)致腫瘤細(xì)胞未能注入裸鼠皮下有關(guān)，接種成功率與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的相似[3-4]。

不同的腫瘤模型建立方法，腫瘤生長(zhǎng)特性也不相同。本次采用SW-13細(xì)胞懸液移植，平均成瘤潛伏期為18 d，移植瘤大小及形狀較為均勻，特別適用與對(duì)腫瘤體積均一性要求高的實(shí)驗(yàn)。從腫瘤生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)，接種后48～60 d腫瘤生長(zhǎng)最為迅速，而此前及此后腫瘤生長(zhǎng)速度均相對(duì)緩慢，腫瘤生長(zhǎng)特征與Pinto研究相近[5]，提示裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)最佳實(shí)驗(yàn)試劑為接種后48～60 d。

移植瘤能否保持腫瘤原有特征是移植瘤模型建立成功的關(guān)鍵[6]。有研究顯示裸鼠肺癌移植模型在生長(zhǎng)過(guò)程中生物學(xué)特征不穩(wěn)定，出現(xiàn)原有標(biāo)志物丟失或產(chǎn)生新的標(biāo)志物。通過(guò)組織病理學(xué)驗(yàn)證，本研究所建立的移植瘤病理學(xué)特征與腎上腺皮質(zhì)腺癌的特征極為相似，提示該模型可用于腎上腺皮質(zhì)癌的實(shí)驗(yàn)研究。

總之，本研究建立的人腎上腺皮質(zhì)癌皮下移植瘤模型具有操作簡(jiǎn)單、觀察方便、成功率高的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于腎上腺皮質(zhì)癌的實(shí)驗(yàn)研究。

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