孔 斌 黑常春 劉 芳 蔡玉芳 朱萬平 余建強(qiáng) 王燕蓉 趙承軍

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系,寧夏 銀川 750004)

雌激素具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、防止神經(jīng)退化及抗凋亡的作用。目前臨床上應(yīng)用雌激素替代療法緩解因雌激素水平低下引發(fā)的臨床癥狀，但外源性的雌激素呈非生理性釋放，有致癌的副作用，目前卵巢移植不僅使女性癌癥患者恢復(fù)了生育能力，而且改善女性內(nèi)分泌平衡，提高患者的生活質(zhì)量。卵巢移植所獲得的內(nèi)源性雌激素對海馬神經(jīng)元凋亡的影響報道少見，本實(shí)驗(yàn)采用去勢SD大鼠模型，對比腎被膜下卵巢移植和腹腔注射己烯雌酚觀察對大鼠腦海馬神經(jīng)元凋亡的影響變化。

1 材料與方法

1.1材料 一抗為兔抗鼠多克隆Bcl-2、Bax(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)；二抗為辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中彬公司)。水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，己烯雌酚(上海通用藥業(yè)股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物和分組 選用清潔級健康SD雌性大鼠60只，體重(200 g±20 g)及出生3 d內(nèi)的SD雌性鼠24只，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔合格證SCXK(寧)2005-0001〕；制備去勢動物模型后隨機(jī)分為己烯雌酚組和卵巢移植組，因?qū)嶒?yàn)中有動物死亡，故每組各時間點(diǎn)7只。

1.2.2動物模型制備 10%的水合氯醛腹腔注射，動物麻醉后，剪去背部毛發(fā)、消毒后，在肋脊角處切開皮膚及肌肉，暴露卵巢，正常對照組只切除卵巢周圍脂肪組織，己烯雌酚組及卵巢移植組分享并切除雙側(cè)卵巢，然后逐層縫合。己烯雌酚組去勢7 d后，隔天腹腔注射己烯雌酚1 mg/kg；卵巢移植組去勢7 d后，將出生3 d內(nèi)SD乳鼠的卵巢移植到腎被膜下。于移植4 d、7 d、14 d和28 d各組動物取血測雌孕激素水平，同時灌注剝離大腦，用于免疫組化。

1.2.3免疫組化 石蠟切片常規(guī)脫蠟至脫水。PBS沖洗，抗原修復(fù)，3% H2O2室溫孵育，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，5%正常山羊血清封閉后，分別滴加Bcl-2、Bax(1∶100)孵育，4℃過夜后，加入二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100)，DAB顯色，脫水，樹膠封片，觀察照相。

2 結(jié) 果

2.1Bax的表達(dá) 己烯雌酚組隨著給藥時間的延長，Bax表達(dá)水平在各區(qū)表現(xiàn)為緩慢降低趨勢，維持在較低的水平，CA3區(qū)Bax的表達(dá)水平高于CA1和DG二區(qū)；卵巢移植組隨著移植時間的延長，Bax的表達(dá)在各區(qū)較同期己烯雌酚組略高，并隨移植時間延長，其表達(dá)略微有所升高。見表1。

2.2Bcl-2的表達(dá) 己烯雌酚組隨著給藥時間的延長Bcl-2表達(dá)水平在各區(qū)無明顯變化，基本維持在一個水平，同樣CA3區(qū)Bcl-2的表達(dá)水平高于CA1和DG二區(qū)；而卵巢移植組隨著移植時間的延長，Bcl-2的表達(dá)呈明顯的上升趨勢，尤以移植14 d和28 d明顯。移植7 d后Bcl-2的表達(dá)水平開始高于同期己烯雌酚組。見表2。

表1 己烯雌酚組和移植組Bax陽性IOD值

表2 兩組Bcl-2陽性IOD值

2.3Bcl-2/Bax的比值 己烯雌酚組隨給藥時間的延長Bcl-2/Bax比值增高緩慢，其中CA1區(qū)增加明顯，其次為DG區(qū)，CA3增加緩慢，不明顯。卵巢移植組隨移植時間的延長Bcl-2/Bax比值上升非常明顯，其中CA1在移植28 d升高更為明顯，28 d移植組各區(qū)Bcl-2/Bax高于同期己烯雌酚組。

3 討 論

Bcl-2和Bax是一對功能上相互對立的凋亡調(diào)控基因，Bcl-2抑制凋亡，Bax促進(jìn)凋亡〔1〕。Bcl-2/Bax比值的高低決定著細(xì)胞受到刺激后趨于存活還是凋亡〔2〕。么冬愛等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)給予外源性雌激素，海馬神經(jīng)元可通過降低Bax的表達(dá)或升高Bcl-2的表達(dá)對抗神經(jīng)元凋亡，從而對神經(jīng)元起保護(hù)作用。本研究表明給予外源性雌激素可以對抗海馬神經(jīng)元的凋亡。與么冬愛等〔3〕研究結(jié)果一致；與阿依木古麗〔4〕應(yīng)用17β-雌二醇使得去卵巢大鼠海馬中Bcl-2蛋白表達(dá)上升和Bax蛋白表達(dá)下降從而對海馬神經(jīng)元起到保護(hù)作用等有所不同。本實(shí)驗(yàn)中給予大鼠腹腔注射己烯雌酚僅使得海馬神經(jīng)元Bax的表達(dá)下降，Bcl-2的表達(dá)不明顯，這可能與本實(shí)驗(yàn)中用的己烯雌酚不如17β-雌二醇的生物活性強(qiáng)有關(guān)。

本研究中，卵巢移植組通過卵巢移植不僅獲得了內(nèi)源性雌激素，同時孕酮水平也較對照組有所提高，卵巢移植的成功還能分泌其他活性因子，這些協(xié)同作用于海馬神經(jīng)元不僅使得促凋亡因子Bax的表達(dá)下降，同時還使得抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)升高，更好更顯著的發(fā)揮抗凋亡作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Rarsten R，F(xiàn)reyer D，Karsch M,etal.Erythropoietin is a paracrinemediator of ischemic tolerance in the brain：evidence from an in vitro model〔J〕. Neurosci，2002;22(23)：10291-301.

2Volpe BT，Davis HP，Towle A,etal.Loss of hippocampal CA1 pyramidal neurons correlates with memory impairment in rats with ischemic or neurotoxin lesions〔J〕.Behav Neurosci，1992;106(3)：457-64.

3么冬愛，章軍建，張曉琴，等.雌激素對腦缺血時Bcl-2蛋白表達(dá)的影響及神經(jīng)保護(hù)作用的研究〔J〕.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2002;14(1)：29-31.

4阿依木古麗.雌激素對去卵巢大鼠大腦皮質(zhì)和海馬中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國獸醫(yī)學(xué)報，2009;29(10)：1307-10.