徐曉玲 曹 麗 沈 琴 戴躍青 王 璐 高蘇俊 王慶娜 田秀春 朱海杭

江蘇省蘇北人民醫(yī)院消化科 揚州大學臨床醫(yī)學院(225001)

膽汁反流性胃炎是慢性胃炎中的一種較常見類型，是由十二指腸胃反流引起的胃黏膜化學性炎癥，與萎縮、腸化生等胃黏膜癌前病變有關[1-2]。細胞周期蛋白D1(cyclin D1)是細胞周期調(diào)節(jié)因子，屬于原癌基因中的一種，其過表達可促進細胞增殖。既往研究[3]指出，cyclin D1與胃癌的關系密切。本研究通過探討cyclin D1在膽汁反流性胃炎和胃癌組織中的表達及其意義，旨在為胃癌的臨床防治提供理論依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

收集2012年6～12月江蘇省蘇北人民醫(yī)院行胃癌根治術的胃癌組織標本50例、癌旁非癌組織(距癌組織邊緣3～5 cm)標本50例、胃鏡下取得的膽汁反流性胃炎組織標本50例。選取同期健康體檢者胃黏膜組織標本50例作為正常對照。胃癌組織和癌旁非癌組織標本經(jīng)HE染色后由組織病理學檢查確診。胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)有綠色或黃色膽汁伴胃黏膜糜爛或充血者診斷為膽汁反流性胃炎[4-5]。入選患者年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義。

二、研究方法

1. 觀察膽汁反流性胃炎胃黏膜病變情況：取膽汁反流性胃炎和正常對照組標本，采用新悉尼系統(tǒng)[6]評價胃黏膜組織腸上皮化生和異型增生的情況。

2. 免疫組化染色：取胃癌組、癌旁非癌組、膽汁反流性胃炎組以及正常對照組標本，蠟塊切片，68 ℃烤片20 min，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水，加熱檸檬酸緩沖液1～2 min至96 ℃，切片置于緩沖液中，微波爐加熱20 min，取出切片自然冷卻至室溫，滴加3% H2O2，37 ℃孵育10 min， PBS沖洗2 min×3次，滴加兔抗人cyclin D1單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)(1∶50)，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗2 min×3次，滴加聚合物輔助劑，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，滴加通用型二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)(1∶50)，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB溶液(北京中杉金橋生物技術有限公司)顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，脫水、透明、干燥、封片，光學顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。

結(jié)果判斷：每例切片隨機選取5個高倍視野進行觀察。Cyclin D1染色陽性為細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，且著色強度高于背景非特異性染色者。參考孫桂彬等[7]的研究，根據(jù)陽性細胞染色強度和陽性細胞比例綜合判斷染色結(jié)果。染色強度：0分，無色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性細胞比例：0分，≤5%；1分，5%～25%；2分，25%～50%；3分，≥50%。陽性標記分數(shù)=陽性細胞染色強度分數(shù)×陽性細胞比例分數(shù)： 0分，(-)；1～3分，(+)；4～5分，(++)；≥6分，(+++)。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、一般情況

胃癌組中男27例，女23例，年齡43～71歲，平均(58.7±7.8)歲；癌旁非癌組中男18例，女32例，年齡33～73歲，平均(56.4±8.7)歲；膽汁反流性胃炎組中男19例，女31例，年齡21～75歲，平均(51.0±16.1)歲；正常對照組中男21例，女29例，年齡19～74歲，平均(50.0±13.1)歲。四組患者性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

二、膽汁反流性胃炎胃黏膜病變情況

χ2檢驗結(jié)果顯示，膽汁反流性胃炎組發(fā)生腸上皮化生和異型增生的比例顯著高于正常對照組(P<0.05)(見表1)。

三、Cyclin D1表達情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，cyclin D1陽性率在正常對照組、膽汁反流性胃炎組、癌旁非癌組以及胃癌組中逐漸升高。胃癌組cyclin D1陽性率顯著高于其余三組(P<0.05)，膽汁反流性胃炎組cyclin D1陽性率顯著高于正常對照組(P<0.05)，癌旁非癌組與膽汁反流性胃炎組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

表1 膽汁反流性胃炎胃黏膜病變情況 n(%)

表2 四組間cyclin D1表達陽性率比較n(%)

討 論

膽汁反流性胃炎是由于幽門功能不全、胃竇十二指腸協(xié)調(diào)運動障礙、胃排空延遲或膽囊功能障礙等因素導致過量含膽汁的十二指腸液返流入胃，破壞胃黏膜表面黏液屏障，損傷黏膜上皮，引起充血、水腫等炎性改變，其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，主要依靠胃鏡診斷。研究[8-11]顯示，長期膽汁反流可導致胃小凹上皮和食管鱗狀上皮增生，并可能與腸化生甚至癌變有關。膽汁反流亦是導致Barrett食管及其惡性進展的重要因素。本研究中，膽汁反流性胃炎組發(fā)生腸上皮化生和異型增生的比例分別為36.0%和44.0%，顯著高于正常胃黏膜組(分別為6%、10%)，提示膽汁反流性胃炎可能與胃癌的發(fā)生有一定關系。

Cyclin D是一組調(diào)控真核細胞周期進展的重要蛋白分子，cyclin D1屬于其中一個重要亞型，是癌基因中的一種。Cyclin D1可結(jié)合細胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4)形成復合物cyclin D1-CDK4，使Rb蛋白磷酸化，解除Rb基因抑制G期的作用。生理狀態(tài)下，細胞進入S期后cyclin D1迅速分解。cyclin D1過表達可縮短G1期，促進細胞進入S期[12]。對胃癌和癌前病變組織的研究[7,13]顯示，胃黏膜上皮癌變早期階段可見cyclin D1過表達，提示cyclin D1是重要的胃癌促發(fā)因素，可作為潛在的胃癌早期診斷的分子標志。

本研究顯示，cyclin D1在正常胃黏膜組織、膽汁反流性胃炎組織、癌旁非癌組織以及胃癌組織中的陽性表達率逐漸升高，且在胃癌組織中顯著高于其余三組，提示cyclin D1在胃癌惡性演變過程中發(fā)揮重要作用。此外，cyclin D1在膽汁反流性胃炎組織中的表達顯著高于正常胃黏膜組織，但在癌旁非癌組織和膽汁反流性胃炎組織中無顯著差異，提示cyclin D1可能參與了膽汁反流性胃炎發(fā)展為胃癌的過程。

綜上所述，膽汁反流性胃炎作為臨床上較常見的一種慢性胃炎，與腸上皮化生和異型增生等胃黏膜癌前病變密切相關。癌基因cyclin D1在胃癌和膽汁反流性胃炎組織中高表達，提示其可能參與了膽汁反流性胃炎發(fā)展為胃癌的過程，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定關系，是重要的胃癌促發(fā)因素，可作為潛在的胃癌早期診斷的分子標志。

1 Dixon MF, Mapstone NP, Neville PM, et al. Bile reflux gastritis and intestinal metaplasia at the cardia[J]. Gut, 2002, 51 (3): 351-355.

2 林金坤，曾志榮，高修仁. 十二指腸胃反流與胃黏膜炎癥關系探討[J]. 中華消化雜志, 2004, 24 (2): 87-89.

3 Maddika S, Ande SR, Panigrahi S, et al. Cell survival, cell death and cell cycle pathways are interconnected: implications for cancer therapy[J]. Drug Resist Updat, 2007, 10 (1-2): 13-29.

4 王吉，顧瑋，葛心怡，等. 膽汁反流性胃炎胃黏膜Th1/Th2平衡的研究[J]. 胃腸病學, 2012, 17 (6): 358-362.

5 中華醫(yī)學會消化病學分會. 全國慢性胃炎研討會共識意見[J]. 中華消化雜志, 2000, 20 (3): 199-201.

6 Dixon MF, Genta RM, Yardley JH, et al. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis, Houston 1994[J]. Am J Surg Pathol, 1996, 20 (10): 1161-1181.

7 孫桂彬，楊景國，李永華，等. PTEN、p16和CyclinD1在胃癌及癌前病變中表達的研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2012, 21 (15): 1614-1615.

8 Dresner SM, Griffin SM, Wayman J, et al. Human model of duodenogastro-esophageal reflux in the development of Barrett’s metaplasia[J]. Br J Surg, 2003, 90 (9): 1120-1128.

9 Jürgens S, Meyer F, Spechler SJ, et al. The role of bile acids in the neoplastic progression of Barrett’s esophagus - a short representative overview[J]. Z Gastroenterol, 2012, 50 (9): 1028-1034.

10 Kauer WK, Stein HJ. Emerging concepts of bile reflux in the constellation of gastroesophageal reflux disease[J]. J Gastrointest Surg, 2010, 14 Suppl 1: S9-S16.

11 Hong J, Behar J, Wands J, et al. Bile acid reflux contributes to development of esophageal adenocarcinoma via activation of phosphatidylinositol-specific phospholipase Cgamma2 and NADPH oxidase NOX5-S[J]. Cancer Res, 2010, 70 (3): 1247-1255.

12 Motokura T, Bloom T, Kim HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl1-linked candidate oncogene[J]. Nature, 1991, 350 (6318): 512-515.

13 Arici DS, Tuncer E, Ozer H, et al. Expression of retinoblastoma and cyclin D1 in gastric carcinoma[J]. Neoplasma, 2009, 56 (1): 63-67.