國 芳 姚瑋艷 戴 欣 王 成 周郁芬 張 帆 袁耀宗*

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科1(200025) 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌位居第四位，且死亡率居高不下，位于惡性腫瘤第二位[1-2]。胃癌的五年生存率與胃癌分期顯著相關(guān)，Ⅰ期可達(dá)90%左右，而Ⅳ期不足5%[3-4]。胃癌早期血清標(biāo)記物可使腫瘤局限于黏膜下層時得到明確診斷并及時采取治療，可大大改善預(yù)后。但目前缺乏胃癌早期敏感的血清指標(biāo)[5]，大多數(shù)患者診斷時已處于進展期甚至伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。

近年發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸(miRNA)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其不僅在腫瘤組織中異常表達(dá)，腫瘤患者血清中亦可見特征性、穩(wěn)定的miRNA表達(dá)譜，對腫瘤的診斷、分類、治療以及預(yù)后均具有重要價值[6-7]。目前已有多項研究[8-9]證實胃癌患者血清miRNA表達(dá)譜存在明顯差異。Liu等[10]通過SOLEXA測序、qRT-PCR法證實五個miRNA(miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34a和miR-423-5p)可作為血清標(biāo)記物診斷胃癌。本實驗在此基礎(chǔ)上，探討這5個血清miRNA對胃癌早期診斷的價值。

對象與方法

一、研究對象

收集2011年7月～2012年2月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院經(jīng)胃鏡或手術(shù)病理檢查證實的胃癌患者180例。其中男120例，女60例；年齡24～89歲，平均(59.3±12.5)歲；進展期胃癌149例，早期胃癌31例。早期胃癌定義沿用1962年日本制定的標(biāo)準(zhǔn)，即術(shù)后病理示腫瘤局限于黏膜層和黏膜下層，伴或不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；進展期胃癌指腫瘤已突破黏膜下層。同時排除其他腫瘤以及系統(tǒng)性疾病患者。收集同期癌前變化(包括癌前狀態(tài)和癌前病變)患者49例，其中胃息肉15例，胃潰瘍25例，癌前病變9例；男37例，女12例；年齡14～81歲，平均(57.0±14.3)歲；收集57名性別、年齡與胃癌患者基本匹配的健康人作為正常對照組，其中男37名，女20名；年齡22～79歲，平均(57.4±12.7)歲。本研究方案經(jīng)上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選者均獲知情同意書。

二、研究方法

1. 標(biāo)本采集：采集病例組未經(jīng)任何治療(放療、化療、手術(shù))的空腹肘部靜脈血2 mL(其中12例進展期胃癌患者同時采集術(shù)后6～8 d血標(biāo)本2 mL)，并采集正常對照組空腹血樣2 mL，1500 r/min離心10 min，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)錂z。

2. 血清miRNA提取：取100 μL樣品加入300 μL DEPC水，酸性酚-氯仿法提取總RNA，所提取的RNA加入20 μL DEPC水溶解沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 制備cDNA：所提取RNA與AMV酶(Takara公司)、RT-primer(ABI公司)等制備逆轉(zhuǎn)錄體系，合成cDNA。

4. 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法：參照Taqman miRNA(ABI公司)qRT-PCR說明書制備反應(yīng)體系，于ABI Prism 7300熒光定量PCR儀中行擴增和熒光信號檢測，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)。以let-7作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算各目標(biāo)miRNA相對表達(dá)量，結(jié)果用倍數(shù)表示(fold change)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、血清miRNA檢測結(jié)果

qRT-PCR結(jié)果顯示，胃癌患者中miR-1、miR-20a、miR-34a、miR-423-5p的表達(dá)分別為正常對照組的2.40倍(P<0.000 1)、2.00倍(P<0.000 1)、1.36倍(P=0.001 0)、1.28倍(P=0.049 6)，尤以前兩者升高更為顯著；miR-27a表達(dá)雖有所上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.059 9)。早期胃癌miR-1和miR-20a表達(dá)分別為正常對照組的1.80和1.45倍(P均<0.000 1)，其余miRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。進展期胃癌患者miR-1、miR-20a、miR-34a、miR-423-5p表達(dá)分別為正常對照組的2.53倍(P<0.000 1)、2.11倍(P<0.000 1)、1.38倍(P=0.000 5)、1.31倍(P=0.024 5)，且均高于早期胃癌組，但僅miR-1表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012 1)，提示miR-1表達(dá)可能與胃癌分期相關(guān)。與正常對照組相比，癌前變化組miR-1、miR-20a、miR-34a表達(dá)分別升高1.21、1.15、1.16倍，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。miR-1、miR-20a、miR-34a表達(dá)在癌前變化-早期胃癌-進展期胃癌三個不同階段中呈動態(tài)升高的趨勢(見表1、圖1)。

二、術(shù)前、術(shù)后miRNA表達(dá)比較

12例進展期胃癌患者術(shù)后五個miRNA表達(dá)均不同程度下降，其中miR-1表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018 5)(見表2)。 提示miRNA可能可作為胃癌隨訪監(jiān)測的指標(biāo)。

表1 各組五個血清miRNA檢測結(jié)果

*與正常對照組比較，P<0.05；#與早期胃癌組比較，P<0.05

表2 進展期胃癌患者術(shù)前、術(shù)后miRNA表達(dá)比較

NC：正常對照組；PC：癌前變化組；EGC：早期胃癌組； AGC：進展期胃癌組；GC：胃癌組

三、胃癌組與早期胃癌組特異性血清miRNA的ROC曲線分析

選取胃癌患者表達(dá)顯著升高的4種miRNA和早期胃癌患者表達(dá)顯著升高的2種miRNA，繪制單獨或聯(lián)合ROC曲線。結(jié)果顯示miR-1、miR-20a、miR-34a、miR-423-5p診斷胃癌的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.894 9、0.814 8、0.644 8、0.589 7，四者聯(lián)合的AUC為0.921 1。miR-1和miR-20a診斷早期胃癌的AUC分別為0.813 8、0.774 2，兩者聯(lián)合的AUC為0.865 3。

miR-1診斷胃癌的敏感性和特異性分別為87.3%和77.1%，miR-20a分別為87.6%和 64.1%，miR-34a分別為59.4%和67.8%，miR-423-5p分別為87.3%和31.6%，miR-1與miR-20a聯(lián)合的敏感性和特異性分別為77.1%和81.4%，四者聯(lián)合的敏感性和特異性分別為85.8%和83.3%。miR-1診斷早期胃癌的敏感性和特異性分別為79.0%和 70.9%，miR-20a分別為66.9%和87.0%，兩者聯(lián)合的診斷敏感性和特異性分別為80.5%和83.6%。

討 論

目前我國早期胃癌診斷率仍遠(yuǎn)低于日本，尋找敏感的腫瘤標(biāo)記物可能有助于提高早期胃癌診斷率。但目前應(yīng)用較多的CA724、CA19-9、CEA等指標(biāo)的敏感性與特異性在胃癌診斷中尚不盡如人意，在胃癌早期診斷中的應(yīng)用更局限[5]，如何找到胃癌高位預(yù)警、早期診斷與預(yù)后判斷的生物標(biāo)記物，始終是困擾臨床工作者的一大難題。

miRNA為目前研究最為廣泛的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可與蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)后與靶標(biāo)mRNA以堿基互補方式結(jié)合，進而降解靶標(biāo)分子或抑制蛋白的翻譯過程。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控超過1/3的蛋白編碼基因[11]，在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。目前miRNA在多種腫瘤中的特異性表達(dá)及其診斷作用已被證實[12-14]，其在胃癌診斷方面亦有重要作用。

有研究[15]認(rèn)為miR-1和miR-27a可作為良好的標(biāo)記物預(yù)測胃癌患者對化療的反應(yīng)，低表達(dá)miR-1和miR-27a者有較好的化療敏感性。 Li等[16]發(fā)現(xiàn)miR-20a可通過調(diào)節(jié)EGR2信號通路發(fā)揮促進胃癌細(xì)胞生長、遷徙、浸潤的作用；Cai等[17]采用qRT-PCR法檢測90例胃癌患者和90名正常對照組多種血清miRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示胃癌患者中血清miR-20a表達(dá)較正常對照顯著升高。Osawa等[18]對胃癌患者的石蠟包埋組織行miRNA檢測發(fā)現(xiàn)，miR-34a在胃癌組織中過表達(dá)，多變量Cox比例風(fēng)險模型結(jié)果顯示miR-34a可作為胃癌獨立的預(yù)后因素。有研究[19]發(fā)現(xiàn)miR-423-5p可通過抑制TFF1抑癌基因的表達(dá)促進胃癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-1、miR-20a、miR-34a、miR-423-5p表達(dá)在胃癌患者中上升顯著，且聯(lián)合診斷胃癌的敏感性和特異性較高，優(yōu)于He等[20]的研究中CA19-9、CEA等指標(biāo)的診斷效能；Chen等[21]基于中國人群的meta分析顯示，CA724+CA19-9+CEA聯(lián)合診斷胃癌的敏感性為74%。

以往國內(nèi)外miRNA與胃癌的報道多以胃癌組織為研究對象，臨床上難以用于開展胃癌普查工作。目前逐漸開展血清miRNA在胃癌診斷中的研究，但胃癌早期診斷的報道不多見。本研究進一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)miR-1、miR-20a表達(dá)在早期胃癌階段即已發(fā)生顯著改變。提示其可作為胃癌早期診斷的標(biāo)記物。有研究[22]發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p表達(dá)在胃癌早期即發(fā)生變化；Li等[23]的研究發(fā)現(xiàn)早期胃癌患者血清miR-223、miR-21表達(dá)顯著上升。上述研究說明miRNA表達(dá)與胃癌關(guān)系密切，可在癌腫病變早期、局限時即發(fā)生變化，并可于血清中檢出，miRNA有潛力作為候選腫瘤標(biāo)記物診斷早期胃癌。

本研究中miR-1與miR-20a聯(lián)合診斷早期胃癌的AUC為0.865 3，高于ITIH3(AUC=0.864)[24]和miR-199a-3p(AUC=0.818)[22]等的胃癌早期診斷效能。本研究中癌前變化組部分miRNA表達(dá)已有所增高，而進展期胃癌各個miRNA表達(dá)均較早期胃癌有一定程度的上升，其中miR-1的升高有統(tǒng)計學(xué)意義；提示miRNA表達(dá)可能在胃癌癌前病變狀態(tài)就發(fā)生一定改變，而miRNA表達(dá)與胃癌分期密切相關(guān)，顯示出其作為胃癌標(biāo)記物用于早期診斷的優(yōu)勢。

本研究還發(fā)現(xiàn)進展期胃癌患者術(shù)后5個miRNA有不同程度下降，其中miR-1的下降差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示miRNA可能可作為預(yù)后隨訪監(jiān)測的標(biāo)記物。Huang等[15]的研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-1患者肝臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生率更高，一定程度上提示其在預(yù)后中的作用。擬后續(xù)延長隨訪時間，進一步評估m(xù)iRNA在胃癌隨訪監(jiān)測中的價值。

綜上所述，本研究所采用的5個血清miRNA分子診斷模型具備采集方便、敏感性高、可用于早期診斷、隨訪監(jiān)測等特點，為胃癌早期診斷的研究提供了新的思路。但目前不同研究報道[10,17,25,26]的血清miRNA表達(dá)譜結(jié)果一致度不高，故如何建立一個良好、可重復(fù)性高的miRNA診斷模型等問題仍需進一步研究。

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