王 彬，曹允考，魏亞松，常淑偉，胡 倩，溫建新

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

近年來，養(yǎng)殖業(yè)已成為我國重要的支柱產(chǎn)業(yè)，與人們的生活息息相關(guān)。然而，一些動物腸道性疾病頻繁發(fā)生，養(yǎng)殖業(yè)大量濫用抗生素來防治動物疾病，從而導(dǎo)致動物體內(nèi)藥物殘留、細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)等問題。抗生素類藥物既可以抑制病原菌，也對動物體內(nèi)的益生菌有抑制作用，破壞動物腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，增加幼齡動物對于病原菌的易感性，使得養(yǎng)殖場內(nèi)幼齡動物腹瀉致死現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)。而含有益生菌的微生態(tài)制劑能夠改善因長期使用抗生素藥物所帶來的副作用。微生態(tài)制劑能夠調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，具有無毒副作用、無藥物殘留、細(xì)菌不產(chǎn)生耐藥性等特點，從而防治動物腸道疾病，提高動物的生產(chǎn)性能和抗病能力，以獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益，所以微生態(tài)制劑的研究在養(yǎng)殖行業(yè)、科研方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。

微生態(tài)制劑的研究和應(yīng)用已成為當(dāng)今微生物學(xué)、飼料學(xué)、食品科學(xué)與安全、微生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點，日益受到人們的高度關(guān)注。我國農(nóng)業(yè)部于2003年公布15個可直接用于生產(chǎn)動物飼料添加劑菌種，包括干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等；2005年版的飼料添加劑品種目錄允許使用微生物菌種增加了3種[4-5]。

本文從健康的雞腸道中分離出芽孢桿菌，并對該菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rRNA序列分析及同源性比較檢測該菌株對抗菌藥物的敏感性和對所飼喂動物生長的影響，為今后開發(fā)安全、有效的微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

試驗動物為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防實驗室飼喂的健康雞。

1.2 試驗儀器

超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)），TDL80-2號型飛鴿牌臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)），電子調(diào)溫萬用電爐（山東龍口市先科儀器公司生產(chǎn)），YY0027-90型電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東龍口市先科儀器公司生產(chǎn)），YXQ-LS-18SI型手提式不銹鋼蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)），HZQ-C空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)），顯微鏡等。

1.3 試驗試劑

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，半固體培養(yǎng)基，西蒙氏培養(yǎng)基，糖醇苷生化反應(yīng)試劑和藥敏紙片（購自杭州天和微生物制劑有限公司），革蘭氏染液（購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司），0.5%沙黃溶液，5%孔雀綠染液，革蘭氏碘液，甲基紅指示劑，戊醇，吲哚指示劑，TE緩沖液，溶菌酶，蛋白酶K，十二烷基酸鈉（SDS），70% 乙醇，氯仿/異戊醇，酚/氯仿/異戊醇，無水乙醇，Premixed Taq（incl dye）、DL 2000 DNA Marker、電泳級瓊脂糖Agarose Regular（購自大連寶生物工程有限公司）等。

2 試驗方法

2.1 樣品的采集與處理

無菌條件下剖殺健康育成雞取腸道，剪碎腸組織置于含有無菌生理鹽水的試管中，并充分震蕩混勻30 min，制成勻漿后離心，取上清液得到菌懸液，在70℃水浴中孵育20 min。

2.2 菌株的分離純化

用微量移液器吸取菌懸液100 μL，無菌條件下，涂布普通營養(yǎng)瓊脂平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；無菌挑取涂布平板上的單菌落，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，進(jìn)行純化，以獲得純化菌種。

2.3 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 菌落特征的觀察

取純培養(yǎng)物，劃線接種在普通營養(yǎng)培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。

2.3.2 革蘭氏染色

取干凈的載玻片進(jìn)行抹片，干燥、固定；滴加結(jié)晶紫溶液，染色1 min，水洗；滴加碘液1 min，水洗；滴加脫色溶液，脫色30 s，水洗；滴加復(fù)染溶液，復(fù)染30 s，水洗；用干凈的吸水紙吸干，置于油鏡下觀察。

2.3.3 芽孢染色

取干凈的載玻片抹片，干燥固定后，滴加5%孔雀綠染液，加熱，產(chǎn)生蒸汽4次，水洗；以復(fù)染溶液復(fù)染30 s，水洗，吸干，置于顯微鏡下觀察。

2.4 細(xì)菌的生化試驗

根據(jù)芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)等特點，對分離到的芽孢桿菌進(jìn)行枸櫞酸鹽利用試驗、糖醇苷發(fā)酵試驗、維培二氏（VP）試驗、甲基紅（MR）試驗、明膠液化試驗等[6]。

2.4.1 枸櫞酸鹽利用試驗

無菌操作條件下，用滅菌的接種針取待檢菌株，將枸櫞酸鹽試管放平，進(jìn)行斜面劃線后穿刺到培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃恒溫環(huán)境下，培養(yǎng)24 h，觀察顏色變化，若培養(yǎng)基的顏色由草綠色變?yōu)樗{(lán)色則為陽性，以“+”表示，反之為陰性，以“-”表示。

2.4.2 糖醇類發(fā)酵試驗

無菌操作條件下，用滅菌的接種環(huán)挑取待檢菌株，接種于微量生化反應(yīng)管的培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果，若培養(yǎng)液由紫色變?yōu)辄S色，表示糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，以“+”表示；若管內(nèi)培養(yǎng)液由紫色變?yōu)辄S色且反應(yīng)管內(nèi)有氣泡出現(xiàn)，則表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，以“⊕”表示；若顏色未改變，則表示對糖類不發(fā)酵，以“-”表示。

2.4.3 七葉苷水解試驗

無菌操作條件下，將待檢菌接種到七葉苷的微量反應(yīng)管內(nèi)的培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察試驗結(jié)果，若管內(nèi)的培養(yǎng)液變黑者為陽性，以“+”表示，反之為陰性，以“-”表示。

2.4.4 維培二氏試驗

無菌操作條件下，將待檢菌接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h后，加入6%α-萘酚酒精溶液和40%氫氧化鉀數(shù)滴，振蕩混合，觀察結(jié)果，若在5 min內(nèi)出現(xiàn)粉紅色反應(yīng)則為陽性，以“+”表示；若長時間無反應(yīng)，且置于37℃培養(yǎng)4 h后，顏色仍不變者為陰性，以“-”表示。

2.4.5 甲基紅試驗

無菌操作條件下，將待檢菌接種于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，加入甲基紅指示劑，觀察顏色變化，若無顏色變化可繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d再進(jìn)行試驗。若培養(yǎng)液呈紅色，則為陽性，以“+”表示；若呈黃色，則為陰性，以“-”表示。

2.4.6 吲哚試驗

無菌操作條件下，將待檢菌接種到含蛋白胨水的生化反應(yīng)管內(nèi)的培養(yǎng)基中，置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，然后先加戊醇1滴，沿管壁加入吲哚試劑2滴。培養(yǎng)液表層出現(xiàn)玫瑰紅則為陽性，以“+”表示；不變色為陰性，以“-”表示。

2.4.7 明膠液化試驗

無菌操作條件下，用接種針取待檢菌穿刺接種于明膠約為2/3深度培養(yǎng)基內(nèi)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果。明膠被液化則為陽性，以“+”表示；否則為陰性，以“-”表示。

2.4.8 淀粉水解試驗

無菌操作條件下，將待檢菌接種于含淀粉的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，分區(qū)劃線，置于37℃培養(yǎng)24 h，形成單菌落后，在菌落處滴加革蘭氏碘液，鋪滿菌落，觀察顏色變化。若培養(yǎng)基出現(xiàn)藍(lán)色，菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈，則能水解淀粉為陽性，以“+”表示；反之為陰性，以“-”表示。

2.4.9 硫化氫試驗

無菌操作條件下，用滅菌的接種環(huán)取待檢菌，接種到微量反應(yīng)管內(nèi)的培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察試驗現(xiàn)象。培養(yǎng)基變黑則產(chǎn)硫化氫為陽性，以“+”表示；否則為陰性，以“-”表示。

2.4.10 觸酶試驗

無菌操作條件下，取3%過氧化氫溶液2 mL，加入到干凈的小試管中，用細(xì)玻璃棒蘸取菌液，插入過氧化氫液面下，觀察反應(yīng)。有氣泡產(chǎn)生為陽性，以“+”表示；否則為陰性，以“-”表示。

2.5 16S rRNA的PCR擴(kuò)增與序列分析

2.5.1 細(xì)菌DNA的提取

無菌操作挑取待檢單菌落，接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基后，震蕩搖勻，過夜培養(yǎng)，取菌懸液3 mL放入離心管中，5 000 rpm離心10 min，棄上清，取沉淀物，加50 mg·mL-1溶菌酶75 μL和TE緩沖液0.5 mL懸浮沉淀，置于40℃的恒溫水浴鍋中溫育0.5 h，然后加20 μg · mL-1蛋白質(zhì)酶K 5 μL，再加10%SDS 50 μL，混勻，置于37℃溫育0.5 h；加5 mol· L-1Nacl 750 μL，混勻，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，5 000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)上清液至新的離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，靜止10 min，5 000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)上清液至新的離心管；加入2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，輕微混勻，室溫下沉淀靜止30 min，然后7 000 rpm離心10 min；加入70%乙醇1 mL漂洗DNA，混勻，再5 000 rpm離心5 min，棄上清液，37℃恒溫箱干燥，30 min后溶于40 μL的TE溶液，保存在-20℃冰箱中備用[6-7]。

2.5.2 PCR擴(kuò)增

芽孢桿菌的正向引物序列為：5'-AgAgTTT?gATCCTggCTCAg-3'，反向引物序列為：5'-AAgg AggTgATCC AgCCgCA-3'[8-9]。

PCR 擴(kuò)增體系（25 μL）：Premixed Taq 12.5 μL，正反向引物各加 0.5 μL，DNA 模板 1μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序為：94℃5 min，預(yù)變性；94℃30 s，變性，58℃30 s，退火，72℃1 min，延伸，循環(huán)30次；72℃7 min，延伸。得到的PCR產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

制備1.0%的瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖0.2 g，加入1×TAE的電泳緩沖液20 mL，加熱溶解后待瓊脂糖凝膠液冷卻至65℃，加入6×Gold View 1 μL。待瓊脂糖凝膠凝固后，拔出梳子放入加有1×TAE的電泳槽。吸取PCR產(chǎn)物5.0 μL與Loading Buffer 1.0 μL混合，加樣于瓊脂糖凝膠點樣孔中進(jìn)行電泳，30 min后，取出膠塊，置于凝膠成像系統(tǒng)中，拍照，觀察結(jié)果。

2.5.3 16S rRNA序列測定與分析

將PCR產(chǎn)物（編號命為W）送至北京六合華大基因科技股份有限公司青島測序部進(jìn)行測序；測序結(jié)果使用DNAStar 7.1軟件包中的SeqMan進(jìn)行序列拼接；采用NCBI的BLAST功能將測得的基因序列與數(shù)據(jù)庫中已收錄的芽孢桿菌屬16S rRNA的序列進(jìn)行比對，并使用MegAlian中的Clustal X Method進(jìn)行同源性比較。

2.6 藥敏試驗

采用紙片擴(kuò)散試驗法（K-B法），根據(jù)抑菌環(huán)大小，判斷分離到的菌株對18種常見的抗菌藥物是否敏感[6]。

無菌條件下，用已滅菌的接種環(huán)挑取單菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃空氣浴振蕩器震蕩，過夜培養(yǎng)。

微量移液器吸取菌液，每個平板涂布菌液100 μL，滴于普通營養(yǎng)瓊脂表面，均勻涂布后，蓋好平皿，置于室溫干燥5 min，待平皿表面干后，用滅菌的鑷子以無菌操作取出含藥紙片貼于培養(yǎng)基表面，靜止一段時間后放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)16 h，觀察抑菌結(jié)果并用游標(biāo)卡尺量取各藥片組的抑菌圈直徑大小，運用EXCEL軟件計算其平均值，同時根據(jù)《抗微生物藥物敏感性實驗規(guī)范》，判斷藥敏效果[10]。

2.7 動物安全性試驗

用分離到的菌懸液對小鼠進(jìn)行灌喂試驗。無菌條件下，挑取單菌落接種到5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，震蕩搖勻過夜培養(yǎng)，吸取菌懸液灌喂小鼠0.3 mL·只-1，連續(xù)灌喂7 d，設(shè)空白組為對照組，每組3只，每天觀察試驗組與對照組小鼠的生長情況[11]。

2.8 數(shù)據(jù)分析

藥敏試驗各組數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件進(jìn)行處理，試驗結(jié)果以平均值表示，并與藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，判斷藥敏性大小。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株形態(tài)特征及染色結(jié)果

試驗分離到1株菌株，編號為W。接種在普通營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h后，菌落白色，不透明，邊緣不光滑不規(guī)則，大致為圓形，中央呈花狀，花狀中央半透明；革蘭氏染色為藍(lán)紫色，桿菌；芽孢染色菌體呈紅色，芽孢呈綠色，芽孢近中生，橢圓形或圓形，初步斷定為芽孢桿菌。W菌的形態(tài)特征、革蘭氏染色和芽孢染色圖見圖1。分別編號為A、B、C。

3.2 生化鑒定結(jié)果

試驗分離到的1株芽孢桿菌，通過細(xì)菌培養(yǎng)、革蘭氏染色、芽孢染色和生化試驗，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步鑒定W為枯草芽孢桿菌[12]。菌株生理生化試驗結(jié)果見表1。

3.3 16S rRNA序列分析

3.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的結(jié)果

通過凝膠成像系統(tǒng)照相并觀察發(fā)現(xiàn)，有明顯均勻的目的條帶且無明顯拖尾的現(xiàn)象，W菌株P(guān)CR產(chǎn)物的凝膠電脈圖譜見圖2。

圖1 W菌株形態(tài)特征、革蘭氏染色和芽孢染色圖

表1 菌株生理生化試驗結(jié)果

3.3.2 16S rRNA測序及分析

將該編號為W的序列與數(shù)據(jù)庫中已收錄的芽孢桿菌屬16S rRNA的序列進(jìn)行比對，并使用Me?gAlian中的Clustal X Method進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，比對的幾個菌株的同源性均為98.2%～99.5%。W與其他菌株核酸序列的同源性比較結(jié)果見圖3。

圖2 W菌株P(guān)CR產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜

由圖3可知，編號為W菌株的核酸序列與Ba?cillus subtilis strain CICC 10023（GU980947.1）的同源性達(dá)到99.5%，因此，W被鑒定為枯草芽孢桿菌。

3.4 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)對試驗結(jié)果進(jìn)行判斷。藥敏試驗結(jié)果見表2。

圖3 W與其他菌株的核酸序列的同源性比較結(jié)果

表2 藥敏試驗結(jié)果

通過與標(biāo)準(zhǔn)表對比可知，該菌株對青霉素、桿菌肽耐藥，對四環(huán)素、潔霉素、多粘菌素B中度敏感，對其他抗菌藥物敏感。

3.5 動物安全性試驗結(jié)果

在連續(xù)灌喂7 d內(nèi)，小鼠采食正常、飲水正常、糞便正常、精神狀態(tài)良好；剖檢后，與對照組相比，試驗組的小鼠內(nèi)臟器官無顯著的病理組織學(xué)變化。說明本試驗分離到的芽孢桿菌對小鼠沒有毒性作用，可確定該菌株為無毒菌株。小鼠剖檢結(jié)果見圖4。

圖4 小鼠剖檢結(jié)果

4 討 論

4.1 菌株鑒定

傳統(tǒng)的鑒定方法是從菌落形狀、大小、染色結(jié)果等方面判斷，通過設(shè)計一系列的生化實驗，來粗略鑒定，具有耗時長、易干擾、誤差大等缺點。而分子生物學(xué)鑒定技術(shù)從基因水平對本菌株進(jìn)行鑒定，具有精確、及時、靈敏度高的優(yōu)點。本試驗菌株是從雞腸道中采樣，經(jīng)過70℃水浴孵育20 min的篩選、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實驗和16S rRNA序列分析及同源性比較，結(jié)果表明，W菌株與Bacillus subtilis strain CICC 10023（GU980947.1）的同源性達(dá)到99.5%，因此確定W菌株為枯草芽孢桿菌。

4.2 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對青霉素、桿菌肽耐藥，對四環(huán)素、潔霉素、多粘菌素B中度敏感，對其他抗菌藥物敏感。所以在臨床應(yīng)用時可配合含青霉素、桿菌肽的飼料飼喂患病動物，盡量避免微生態(tài)制劑與含對該菌中度敏感和敏感抗菌藥物的飼料同時使用，特別注意含敏感抗菌藥物飼料的使用，既可提高動物的抵抗力，又可增強(qiáng)微生態(tài)制劑與飼料的應(yīng)用效果。

4.3 對動物安全性

將分離到的懸液對小鼠進(jìn)灌喂試驗結(jié)果表明，試驗分離到的枯草芽孢桿菌對小鼠沒有毒副作用，可確定該菌種對小鼠為無毒菌株，為進(jìn)一步確定該菌株是否能作為微生態(tài)制劑的菌種奠定基礎(chǔ)，也為枯草芽孢桿菌在微生態(tài)制劑的應(yīng)用研究提供依據(jù)。

5 結(jié)論

本試驗通過傳統(tǒng)鑒定方法和分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，從雞的腸道中分離鑒定出一株枯草芽孢桿菌，通過藥敏試驗和動物安全性試驗表明，該菌株對青霉素、桿菌肽耐藥，對小鼠無致病性，為枯草芽孢桿菌在微生態(tài)制劑的研制和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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