謝全喜，趙 攀，王文春，張 文，王曉芳，張建梅*

（1.山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000；2.山東省濟(jì)南育賢中學(xué)，濟(jì)南 250022）

環(huán)磷酰胺（CTX）是一種細(xì)胞毒化療藥物，同時(shí)也屬于烷化劑類(lèi)免疫抑制劑，其作用主要是通過(guò)與DNA雙鏈交叉連接破壞DNA結(jié)構(gòu)，從而阻斷其復(fù)制，破壞免疫活性細(xì)胞，抑制其免疫性能[1]。CTX是已知最強(qiáng)的烷化劑類(lèi)免疫抑制劑，對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異性免疫有很強(qiáng)的免疫抑制作用[2-3]。在免疫調(diào)節(jié)藥物的研究中，CTX經(jīng)常被用來(lái)制備非特異性免疫功能低下模型?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，很多中草藥含有多糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、生物堿類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)等物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力。紫莖澤蘭脫毒草粉的有效成分綠原酸具有廣泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤及增強(qiáng)免疫力的作用。板藍(lán)根具有抗菌、抗病毒及提高免疫力等作用，有研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根多糖能增強(qiáng)抗體形成細(xì)胞功能，增強(qiáng)小鼠靜脈注射碳粒廓清速率。紫錐菊提取物可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。發(fā)酵中草藥是將天然中草藥提取液用益生菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)過(guò)微生物轉(zhuǎn)化成為能夠被機(jī)體腸道直接吸收的小分子成分，使中草藥成為快速吸收、定量療效的新型藥物。本試驗(yàn)將3種中草藥聯(lián)合，用芽孢菌7348對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，研究其對(duì)CTX免疫抵制小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)純系昆明小白鼠，體重20±2 g，雌雄各半，由山東魯抗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試驗(yàn)材料

CTX由山西泰盛制藥有限公司提供；中草藥紫莖澤蘭脫毒草粉購(gòu)自昆明科寶飼料科技有限公司；紫錐菊末購(gòu)自齊魯動(dòng)物保健品有限公司；板藍(lán)根購(gòu)自泰安市永春堂永興藥店；芽孢菌7348為山東寶來(lái)利來(lái)生物菌種保藏中心保存。

準(zhǔn)確稱(chēng)取紫莖澤蘭脫毒草粉5 g、板藍(lán)根2 g和紫錐菊3 g，溶于100 mL蒸餾水中，盛放于500 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min。按活菌數(shù)106cfu·mL-1接種芽孢菌7348，振蕩培養(yǎng)48 h，鏡檢芽孢脫落＞95%。將發(fā)酵液在45℃烘箱中烘干，用研缽研磨備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 免疫低下模型的建立及給藥

將100只昆明小鼠預(yù)飼3 d后隨機(jī)分為5組，每組20只，雌雄各兩個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只，各重復(fù)小白鼠分籠飼喂基礎(chǔ)飼糧。分別為正常組、模型組及發(fā)酵中草藥低、中、高劑量組，中草藥組用發(fā)酵中草藥水溶液灌胃，劑量分別為100、200和400 mg·kg-1（灌胃劑量按小白鼠的采食量計(jì)算），1次·d-1，連續(xù)20 d。正常組和模型組灌胃蒸餾水。在灌胃的第5天開(kāi)始，除正常組外，模型組和發(fā)酵中草藥組均腹腔注射CTX 40 mg·kg-1·d-1，連續(xù)5 d。

1.3.2 免疫器官指數(shù)

檢測(cè)末次給藥24 h后，稱(chēng)量小鼠體重，斷頸處死，分離脾臟和胸腺，迅速剝離脂肪和其他結(jié)締組織后，濾紙吸凈臟器表面血污，稱(chēng)重。計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，免疫器官指數(shù)計(jì)算公式見(jiàn)式1。

1.3.3 血清生化指標(biāo)

末次給藥24 h后，小鼠眼球取血，3 000 rpm離心10 min分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）含量。

1.3.4 單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能

末次給藥24 h后，稱(chēng)量小鼠體重，按劑量0.1 mL·10 g-1給各小鼠尾靜脈注射印度墨汁20%；注射后2和20 min分別從小鼠的左眼眶和右眼眶取血20μL，加入0.1%NaCO3溶液10 mL，搖勻，于600 nm處測(cè)光密度值（OD值）；為校正因各小鼠脾臟、肝臟質(zhì)量不同產(chǎn)生的差異，取血完畢后，斷頸處死小鼠，取肝臟、脾臟，用濾紙吸凈臟器表面血污，稱(chēng)重。廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)計(jì)算公式見(jiàn)式2～3。

式中，OD1、OD2分別為2和20 min時(shí)，取血測(cè)得的光密度值，t2、t1為注射印度墨汁后采血時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析采用Oneway ANOVA進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

各組小鼠脾臟的變化見(jiàn)附圖。

附圖 發(fā)酵中草藥對(duì)小鼠脾臟的影響

由附圖可見(jiàn)，2-模型組小鼠脾臟與1-正常組和中草藥組小鼠脾臟相比，體積顯著縮小，而3個(gè)發(fā)酵中草藥組脾臟體積變化不顯著。

發(fā)酵中草藥對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵中草藥對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響mg·kg-1

由表1可知，與正常組相比，模型組和發(fā)酵中草藥高、中、低劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均極顯著降低（P＜0.01）；而與模型組相比，發(fā)酵中草藥高、中、低劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.05），同時(shí)極顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)（P＜0.01），其中以中劑量發(fā)酵中草藥效果最佳，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別比模型組高20.31%和71.64%。

2.2 對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

發(fā)酵中草藥對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵中草藥對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

由表2可知，與正常組相比，模型組ALT、AST和BUN含量均極顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，發(fā)酵中草藥給藥組ALT和AST含量顯著低于模型組（P＜0.05），且BUN含量極顯著低于模型組（P＜0.01）。在降低AST和BUN含量方面，發(fā)酵中草藥中劑量組添加效果最佳，分別降低11.52%和12.92%。

2.3 發(fā)酵中草藥對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

發(fā)酵中草藥對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響見(jiàn)表3。

表3 發(fā)酵中草藥對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

由表3可知，與正常組相比，模型組和發(fā)酵中草藥3個(gè)劑量給藥組廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)均極顯著降低（P＜0.01），而3個(gè)給藥組的吞噬指數(shù)顯著將降低（P＜0.05）；發(fā)酵中草藥3個(gè)劑量給藥組的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)均顯著高于模型組（P＜0.05），其中以中劑量組效果最好，分別提高54.88%和27.85%。

3 討論

3.1 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟分屬于中樞免疫器官和外周免疫器官，胸腺是T淋巴細(xì)胞成熟的場(chǎng)所，脾臟是成熟淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞定植的場(chǎng)所，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)可直觀的反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[4-5]。受抗原刺激后，參與免疫的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量增生，促進(jìn)免疫器官發(fā)育；但受到免疫抑制影響時(shí)，淋巴組織萎縮，導(dǎo)致免疫器官體積縮小，免疫器官指數(shù)降低[6]。本試驗(yàn)中小鼠灌服發(fā)酵中草藥后，3個(gè)給藥劑量組均可使CTX造成的胸腺萎縮小鼠的胸腺指數(shù)極顯著提高（P＜0.01），同時(shí)顯著提高脾臟指數(shù)（P＜0.05），雖然未恢復(fù)到正常水平，但顯示出其對(duì)CTX造成的免疫低下小鼠脾臟和胸腺的保護(hù)作用，其中以中劑量組添加效果最佳。

3.2 對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

ALT和AST活性是反映肝臟和心臟功能的重要指標(biāo)。在正常情況下，這些酶主要存在于肝細(xì)胞中，血液中含量很少，只有在肝臟受損時(shí)才會(huì)大量釋放進(jìn)入血液，所以血清中ALT和AST被認(rèn)為是肝細(xì)胞受損傷最敏感的指標(biāo)。BUN是體內(nèi)氨基酸分解代謝的終產(chǎn)物之一，是反映機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況及蛋白質(zhì)代謝的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為血清BUN水平反映飼料蛋白利用的情況。血清BUN水平升高表示蛋白質(zhì)分解加強(qiáng)，降低表示蛋白質(zhì)合成增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，中劑量給藥組ALT和AST含量顯著高于正常組（P＜0.05），且BUN含量極顯著高于正常組（P＜0.01），但ALT、AST和BUN含量均顯著低于模型組（P＜0.05）。說(shuō)明添加發(fā)酵中草藥200 mg·kg-1對(duì)CTX造成的小鼠肝臟受損有一定程度的恢復(fù)作用。

3.3 對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體最重要的防御系統(tǒng)，其吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一，可以借助測(cè)定血流中碳粒的消失速度來(lái)反映單核巨噬細(xì)胞吞噬異物的能力。小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)是檢驗(yàn)機(jī)體非特異性免疫的方法之一，本實(shí)驗(yàn)中20%的印度墨汁作為一種外來(lái)抗原，經(jīng)小鼠尾靜脈注射進(jìn)入血液循環(huán)，迅速流經(jīng)肝臟與脾臟，墨汁碳粒會(huì)被單核吞噬細(xì)胞所清除，清除率可反映單核吞噬細(xì)胞的吞噬功能，吞噬指數(shù)越高，單核吞噬細(xì)胞的吞噬能力越強(qiáng)。周瓊等用環(huán)磷酰胺致低免疫力小鼠作為模型，再分別用低、中、高劑量的美洲大蠊粉給小鼠灌胃，研究蟲(chóng)粉對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)、血清溶血素含量、外周血CD4/CD8和免疫器官指數(shù)的影響，結(jié)果表明，高劑量蟲(chóng)粉組的血清溶血素含量和外周血CD4/CD8與模型對(duì)照組相比均有顯著提高（P＜0.05），中、高劑量蟲(chóng)粉組吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)比模型對(duì)照組顯著提高（P＜0.05），說(shuō)明美洲大蠊蟲(chóng)粉能提高低免疫力小鼠的免疫功能[7]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)給藥組廓清指數(shù)極顯著低于正常組，且吞噬指數(shù)顯著低于正常組，但3個(gè)劑量給藥組的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)均顯著高于模型組，其中以中劑量組效果最好。說(shuō)明發(fā)酵中草藥200 mg·kg-1可以提高免疫抑制小鼠的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，對(duì)CTX導(dǎo)致的免疫功能低下有一定的恢復(fù)作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵中草藥不同劑量均能夠顯著提高CTX造成的免疫低下小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，同時(shí)降低血液中ALT、AST和BUN含量，顯著提高免疫抑制小鼠的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，其中以中劑量組200 mg·kg-1添加效果最好。

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