王艷彬，吳海峰(.河北省血液中心檢驗科，河北 石家莊 05006；2.河北省胸科醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 05004)

·論著·

非結核分枝桿菌2種培養(yǎng)方法和藥物敏感性試驗研究

王艷彬1，吳海峰2*
(1.河北省血液中心檢驗科，河北 石家莊 050061；2.河北省胸科醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050041)

目的探討B(tài)ACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法和CLSI M24-A微量肉湯稀釋法快速藥敏試驗對非結核分枝桿菌的意義。方法分別采用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法聯(lián)合微量肉湯稀釋法的快速藥敏試驗與L-J固體培養(yǎng)法和絕對濃度藥敏法對48株非結核分枝桿菌進行培養(yǎng)，并對2種方法的培養(yǎng)時間和藥敏報告時間進行比較。結果48株非結核分枝桿菌在BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀的平均陽性報告時間(7.0±5.3)d，L-J培養(yǎng)基平均陽性報告時間(17.5±10.2)d，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。微量肉湯稀釋法結果陽性報告時間為7～14d，L-J固體藥敏試驗陽性報告時間為28d，2種藥敏試驗方法對相同種類藥物的耐藥率分析結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，微量肉湯稀釋法比L-J法可以檢測的藥物種類更多。結論BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法聯(lián)合微量肉湯稀釋法快速藥敏試驗比L-J固體培養(yǎng)法和絕對濃度藥敏法在培養(yǎng)時間、藥敏結果種類和報告時間上優(yōu)勢明顯。

非結核分枝桿菌；微生物敏感性試驗；細菌學技術

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.07.020

分枝桿菌屬除了結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌外統(tǒng)稱為非結核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)，NTM在自然界中廣泛存在，屬于條件致病菌，目前已發(fā)現(xiàn)約160多種。NTM病具有與結核病臨床表現(xiàn)相似的全身中毒癥狀和局部組織損害，與結核病難以區(qū)分，但其治療卻與結核病有不同之處。2000年中華醫(yī)學會結核病學分會制定出《非結核分枝桿菌病診斷與處理指南》，2007年美國胸科協(xié)會(AmericanThoracicSociety,ATS)和美國傳染病學會(InfectiousDiseasesSocietyofAmerica,IDSA)也提出了NTM肺病的臨床和微生物學診斷標準，2種診斷標準大致相同，均提出NTM肺病的診斷主要依靠病原微生物學[1-2]。NTM菌種篩查和藥敏結果在流行病學上和臨床診斷、治療上都有重要意義[3]。本實驗采用BACTECMGIT960液體培養(yǎng)法聯(lián)合CLSIM24-A微量肉湯稀釋法的快速藥敏試驗與經(jīng)典的L-J固體培養(yǎng)法和絕對濃度藥敏法作比較，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2012年1—12月在河北省胸科醫(yī)院就診的患者，采集痰、支氣管鏡灌洗液、膿標本進行分枝桿菌培養(yǎng)，剔除重復送檢患者，共分離出48株NTM。

1.2 標準菌株：結核分枝桿菌H37Rv、牛分枝桿菌購自生物制品研究所。

1.3 儀器、試劑：BACTECMGIT960培養(yǎng)儀，BBLpreparedculturemedia培養(yǎng)管均購自美國BD公司；快速藥敏試驗用肉湯購于上海積彩醫(yī)療器械有限公司公司;改良L-J培養(yǎng)基及藥敏培養(yǎng)基按《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[4]自制。

1.4 方法：快速藥敏試驗根據(jù)CLSIM24-A微量肉湯稀釋法，每種藥物選擇高低2個濃度，將藥物包被在96孔U型微量反應板上。濃度分別為鏈霉素(streptomyci，SM)2、8mg/L,異煙肼(isoniazid，INH)0.4、1.6mg/L，利福平(rifampicin，RFP)2、8mg/L，乙胺丁醇(ethambutol，EMB)4、16mg/L，氧氟沙星(ofloxacinforinjection，OFX)2、8mg/L，左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)2、8mg/L，阿米卡星(amikacin，AK)1、4mg/L，卷曲霉素(capreomycin,CM)2.5、10μg/mL，丙硫異煙胺(protionamide，1314Th)10、40mg/L，力克肺疾(isoniazidaminosalicylate，Dpc)0.5、2mg/L，莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)0.5、2mg/L，環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CPI)1、4mg/L，克拉霉素(clarithromycin，Clr)4、16mg/L，利福布丁(rifabutin,RFB)0.75、3mg/L，利奈唑胺(linezolid，Lz)2、8mg/L，加替沙星(gatifloxacin，Gfx)2、8mg/L。

L-J藥敏培養(yǎng)基按《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[4]每種藥物高低2個濃度。分別為SM10、100mg/L，INH1、10mg/L，RFP50、250mg/L，EMB5、50mg/L，Dpc1、10mg/L，LVFX2、20mg/L

1.5 菌型判定：用于菌型鑒定的C2-羧酸肼噻吩(TCH)100mg/L，對硝基苯甲酸(PNB)500mg/L。PNB-、TCH+為人型結核菌；PNB-、TCH-為牛型結核菌；PNB+、TCH+為NTM。

2 結 果

2.1 2種方法NTM陽性報告時間：48株NTM在BACTECMGIT960培養(yǎng)儀的陽性報告時間2～20d，平均(7.0±5.3)d；L-J培養(yǎng)基陽性報告時間7～52d，平均(17.5±10.2)d。2組差異有統(tǒng)計學意義(t=6.329，P<0.01)。

2.2NTM藥敏結果分析:在報告陽性后涂片抗酸染色確定為抗酸菌陽性，將培養(yǎng)物分別接種微量反應板和L-J藥敏培養(yǎng)基，7～14d后觀察微量反應板各孔的生長情況，進行菌型分型和獲得藥物MIC值。L-J常規(guī)藥敏試驗28d后根據(jù)生長狀況得到藥敏實驗結果。SM、INH、RFP、EMB、LVFX、Dpc這6種常用的抗結核藥物耐藥率均在90%以上，與L-J法檢出的耐藥率相差無幾，見表1。

微量肉湯稀釋法的快速藥敏試驗還可以對OFLX、AK、CM、1314Th、Mfx、CPI、Clr、RFB、Lz、Gfx10種藥物進行藥敏試驗 ，比L-J常規(guī)藥敏試驗所做的藥物種類多，藥物選擇的范圍大，臨床用藥指導意義更大。

表1 NTM 2種藥敏試驗結果Table 1 Two kinds of susceptibility testing for nontuberculous mycobacteria (n=48，n，%)

Sm:streptomyci； Inh：sonicotinic acid hydrazide；Rfp：rifampicin;Emb:ethambutol; Lfx :levofloxacin;Dpc:isoniazid aminosalicylate

3 討 論

NTM廣泛存在于自然界,大部分是腐物寄生菌，主要見于水、土壤和氣溶膠。NTM的疏水特性形成的生物膜使其可持續(xù)生存于供水系統(tǒng)中。人可從環(huán)境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的傳播途徑。與結核分枝桿菌比較，NTM毒力和致病性均較低，通常屬于機會性致病菌。NTM的易感者主要是慢性呼吸道疾病(慢性阻塞性肺疾病、肺結核殘余空洞、矽肺、支氣管擴張癥、肺囊性纖維化等)和免疫抑制者特別是獲得性免疫缺陷病患者，在獲得性免疫缺陷病和免疫受損宿主中，NTM通常表現(xiàn)為播散性。NTM病肺病的臨床特點因為與結核極其相似而極易發(fā)生誤診或漏診，因而對于反復慢性咳嗽咳痰，尤其是有支氣管擴張等慢性呼吸道疾病的患者，肺部出現(xiàn)上述病灶特點，應警惕NTM病感染的可能[2]。

近年來NTM所致疾病報道的增多，越來越引起臨床對分枝桿菌培養(yǎng)和NTM分離鑒定的重視。由于NTM對常用抗結核藥物普遍耐藥，傳統(tǒng)菌種鑒定方法根據(jù)菌株生長速度、色素產(chǎn)生、光反應、生化反應等進行分群，繁瑣費時，不利于指導臨床診斷[5]。因此，快速的菌型分型和藥敏試驗結果對NTM病的確診和治療方案的調(diào)整顯得尤為重要。

L-J培養(yǎng)和藥敏試驗法，NTM培養(yǎng)平均陽性報告時間為(17.5±10.2)d，最快陽性報告時間7d，最慢為52d，抗酸染色確定陽性后接種藥敏培養(yǎng)基大約需要4～8周才能得到藥敏結果。已經(jīng)不能滿足臨床需求。因此，迫切需要一種簡單快速的培養(yǎng)、菌種初篩和藥敏試驗的方法，以幫助臨床制定合理有效的用藥方案。

利用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)基進行分枝桿菌培養(yǎng)，非結核分枝桿菌平均陽性報告時間為(7.0±5.3)d，最快陽性報告時間為2d，最慢為20d。NTM在960培養(yǎng)管中不形成典型的條索狀生長，通過抗酸染色確定為抗酸菌陽性后，根據(jù)CLSI M24-A微量肉湯稀釋法原理，接種包被好的96孔U型微量反應板上，培養(yǎng)7～14d后即可得到菌種鑒定和藥敏試驗結果。

藥敏試驗藥物組合包括了常用的一線和二線抗結核藥物。有研究[6]顯示藥敏試驗結果統(tǒng)計NTM對常用的藥物SM、INH、RFP 3種藥物100%耐藥。另有研究[7]顯示NTM對EMB耐藥率90%以上，對Dpc、Ofx、Lfx、Pto、RFP耐藥率也達到90%以上，對Cip、Gfx、Mfx耐藥率達到70%以上。本研究48株NTM耐藥率非常高，可能與就診的患者大都經(jīng)過其他醫(yī)院的治療或者有不規(guī)范的化療經(jīng)歷有關。

目前國內(nèi)對NTM的分型的檢驗技術尚未普及，核酸探針、PCR技術、基因芯片和細胞壁脂肪酸色譜分析等新技術尚未成熟用于臨床診斷，傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)藥敏方法需要時間長，我們利用現(xiàn)有BACTEC MGIT 960液體快速培養(yǎng)法，結合CLSI M24-A微量肉湯稀釋法可以使NTM的菌型初篩和藥敏結果時間縮短到15～30d，有利于臨床根據(jù)菌種初篩及藥物敏感試驗結果，及時更改治療方案，減輕患者的痛苦和經(jīng)濟負擔。

由于本研究樣本資料均來源于同一醫(yī)院，且樣本量不夠大，只能菌種初篩而不能準確分型，故研究結論尚需要大規(guī)模的實驗進行證實和完善。

[1] Chinese MedicaI Association of tuberculosis．Guidline on diagnosis and treatment of non tuberculous myeobacterial diseases[J].Chin J Tuberculosis Respir Dis，2000，23：650-653.

[2] GRIFFITH DE，AKSAMIT T，BROWN-ELLIOTT BA，et al.An official ATS/IDSA statement：diagnosis，teeatment，and prevention of nontuberculous mycobaeterial diseases[J].Am J Respir Crit Care Med，2007，175(4)：367-416.

[3] 吳龍章，李一耕，蔡杏珊，等.同時從痰液、胸腔積液分離出鳥分枝桿菌1例[J].中華結核和呼吸雜志，2000，23(10)：601.

[4] 中國防癆協(xié)會.結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程[J].中國防癆雜志，1996，18(1)：28-31.

[5] 梁建琴，吳雪瓊，張俊仙，等.應用聚合酶鏈反應-膜芯片技術快速鑒定分枝桿菌菌種[J].河北醫(yī)科大學學報，2004,25(5)：289-291.

[6] FUJITA Y,LSHII S,HIRANO S,et al.A case of lung cancer complicatedwith active non-tuberculous mycobacterium(NTM) infection successfully treated with anti-cancer agents and anti-NTM agents[J].Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi,2011,49(11)：855-860.

[7] 史祥，尹洪云.58例非結核分枝桿菌肺病住院患者的臨床分析[J].臨床肺科雜志，2013,18(2)：311-312.

(本文編輯：劉斯靜)

TWOSETSOFNON-TUBERCULOUSMYCOBACTERIUMCULTUREMETHODANDDRUGSENSITIVITYTESTSTUDY

WANGYanbin1，WUHaifeng2*
(1.ClinicalLaboratory，BloodCenterofHebeiProvince,Shijiazhuang050061,China2.ClinicalLaboratory，ChestHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050041,China)

CT:ObjectiveTostudytheBACTECMGIT960liquidculturemethodandtheCLSIM24-Abrothmicrodilutionmethodforrapidsusceptibilitytestingthesignificanceofnon-tuberculousmycobacteria.MethodsTheBACTECMGIT960liquidculturebrothmicrodilutionmethodcombinedrapidsusceptibilitytesting,andL-Jsolidculturemethodcombinedtheabsoluteconcentrationsusceptibilitymethodwererespectivelyusedin48strainswithnontuberculousmycobacteri,theculturetimeandsensitivityreportingperiodoftwocombinationmethodswerecompared.ResultsTheaveragepositivereporttimein48strainsofnontuberculousmycobacteriaculturewithBACTECMGIT960instrumentwas(7.0±5.3)d,whilethatofL-Jmediawas(17.5±10.2)d,incomparisontheresultsoftwomethodsweresignificantlydifferent(P<0.05),thereportedtimeofbrothmicrodilutionFranceresultswas7-14d,thereporttimeofL-Jsolidsusceptibilitytestwas28d,thecomparisonshowedsignificantdifference,twokindsofsusceptibilitytestingmethodsforthesametypeofdrugresistancerateanalysisshowednosignificantdifference(P>0.05),brothmicrodilutionmethodcandetectmoretypesofdrugsthantheL-Jmethod.ConclusionBACTECMGIT960liquidculturebrothmicrodilutionmethodcombinedrapidsusceptibilitytestinghasobviousadvantagesoverL-Jsolidculturemethodandtheabsoluteconcentrationsusceptibilitymethodintheincubationtimeandsusceptibilityresultsreportingtimetypes.

nontuberculousmycobacteria；microbialsensitivitytests；bacteriologicaltechniques

2013-10-22；

2013-12-30

河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(20100208)

王艷彬(1978-)，男，河北藁城人，河北省血液中心主管檢驗師，醫(yī)學學士，從事病毒學檢驗研究。

*通訊作者。E-mail：haifengwu77@163.com

R378.91

A

1007-3205(2014)07-0797-04