王志超 邸玉琴 周輝 仲智勇 楊曉鋒 李索林

·論著·

腎母細胞瘤血管內(nèi)皮生長因子與微血管密度檢測及臨床意義

王志超 邸玉琴 周輝 仲智勇 楊曉鋒 李索林

目的探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在腎母細胞瘤血管生成中的作用。方法選取2006年1月至2012年1月河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院小兒外科收治的30例腎母細胞瘤中保存完好的腫瘤組織(包括手術切除和活檢)和血清，按美國腎母細胞瘤研究組(NWTSG)標準進行分期，其中Ⅰ期4例，Ⅱ期5例，Ⅲ期18例，Ⅳ期3例。分為Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期2組。應用免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中VEGF表達和MVD，采用ELISA 法檢測各組患兒血清血管內(nèi)皮生長因子，選取20例對照組患兒，并應用統(tǒng)計學方法進行分析。結果腎母細胞瘤VEGF及MVD水平在患兒不同年齡、性別間差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ⅲ+Ⅳ期瘤體中VEGF表達及MVD均高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)；瘤體中VEGF表達與MVD呈正相關(r=0.672，P=0.00047)。結論瘤體中VEGF表達可反映腫瘤MVD；瘤體中VEGF表達和MVD以及血清中VEGF水平均可大致反映腫瘤分期；血清VEGF可能由瘤體分泌。

腎母細胞瘤；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度；兒童；免疫組織化學

腎母細胞瘤又稱為Wilms瘤，是兒童時期最常見的惡性實體腫瘤之一，多發(fā)生于3歲以下嬰幼兒，常以無痛性腹部包塊為主要就診原因。正確判斷臨床分期對選擇治療方案及提高療效至關重要。血管生成在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂原，在多種惡性腫瘤新生血管的形成中發(fā)揮了重要作用，與腫瘤浸潤性生長和轉(zhuǎn)移密切相關[1]。因此，我們擬通過分析不同分期腎母細胞瘤組織與血清中VEGF表達及兩者的關系，同時觀察腫瘤局部微血管密度(micro-vessel density，MVD)，探討VEGF在腎母細胞瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，為臨床診治提供指導和幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2006年1月至2012年1月河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院小兒外科收治的30例腎母細胞瘤患兒，其中男18例，女12例；年齡1歲～5歲，平均年齡(2.3±1.6歲)。所有患兒均經(jīng)活檢或手術后病理證實為腎母細胞瘤，且所有標本獲取前均未行化療或放療。以美國腎母細胞瘤研究組(NWTSG)標準進行分期，其中Ⅰ期4例，Ⅱ期5例，Ⅲ期18例，Ⅳ期3例。分為Ⅰ+Ⅱ期組和Ⅲ+Ⅳ期組進行統(tǒng)計學分析。前者標本來源于術后病理，后者標本來源于活檢。另選取20例非腫瘤(如腎外傷手術探查等)兒童的腎組織及血清標本做對照。切取無關疾病的標本獲得醫(yī)院倫理委員認可和通過。

1.2 方法

1.2.1 標本制備和處理：標本源自手術切除或活檢所得腫瘤組織。取材時切取瘤體相對血供較豐富的實質(zhì)部分，約5 mm×5 mm×5 mm大小，標本均以10%中性甲醛固定，石蠟包埋備用。同時留取30例患兒手術或活檢前1 d清晨空腹靜脈血各2 ml，置于血清分離管中，室溫下血液自然凝固30 min后于3 000 r/min離心15 min，收集上清標本后置-20℃冰箱保存待測。

1.2.2 腫瘤組織中VEGF表達檢測：①免疫組織化學法檢測：兔抗人VEGF多克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、S-P試劑盒均為河北博海生物工程開發(fā)有限公司提供。操作按S-P試劑盒說明書進行。每組均用PBS代替一抗作為陰性對照。已知陽性切片做陽性對照。②結果判定VEGF判定采用半定量記分法結合Berry的分級法：VEGF的陽性表達為胞漿著色，根據(jù)陽性細胞率和陽性細胞著色強度分別記分：與陰性對照相同者記0分，淡黃者記1分，棕黃色者記2分，棕褐色者記3分。陽性細胞在觀察細胞中所占比例：陽性細胞數(shù)≤10%記1分，11%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。兩項分數(shù)乘積0～3分(-) ，4～5分為(+) ，6～7分為(++) ，8分以上為(+++)。≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.2.3 3組血清VEGF水平檢測：血清VEGF濃度采用雙抗體夾心ELISA法測定。ELISA試劑盒購自美國R&D公司。實驗步驟按照說明書指示操作，先將凍存血清標本室溫融化，依次加樣、孵育、洗滌，置于酶標儀在450 nm波長處讀取吸光度OD值，根據(jù)OD值和標準曲線計算血清VEGF的濃度，比較各組間的差異。

1.2.4 3組組織中MVD檢測：以3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，微波抗原修復，滴加CD34一抗，工作濃度1∶50，4℃過夜。滴加生物素標記二抗工作液，室溫孵育10～30 min，PBS沖洗后滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(streptavidin peroxidase，SP)，室溫孵育10～30 min。DAB顯色劑顯色，沖洗，復染，封片，鏡檢。以已知陽性切片做陽性對照。根據(jù)Weidner方法：CD34標記的微血管判定標準是以與背景明顯有別的任何一個棕色染色的內(nèi)皮細胞或細胞叢作為一個血管，只要結構不相連續(xù)，分支結構也作為一個血管計數(shù)。低倍鏡(×100)選擇腫瘤間質(zhì)中MVD最多的區(qū)域(熱點)，再轉(zhuǎn)到中高倍鏡(×200)下計數(shù)3個視野的微血管數(shù)，取其平均值作為MVD。

2 結果

2.1 腎母細胞瘤患兒VEGF、MVD與臨床因素的關系 腎母細胞瘤VEGF表達及MVD水平在患兒不同年齡、性別間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，腎母細胞瘤(Ⅲ+Ⅳ期)VEGF陽性表達和MVD計數(shù)均顯著高于(Ⅰ+Ⅱ期)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 腎母細胞瘤瘤體中VEGF和 MVD值與臨床相關情況分析

2.2 腎母細胞瘤瘤體及血清VEGF與MVD水平比較 瘤體組織及血清VEGF表達均高于對照組(P<0.05)，瘤體組織MVD高于對照組(P<0.05)。Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)。見表2。

表2 2組VEGF與MVD的檢測

組別VEGF[例(%)]sVEGF(ng/L)MVDⅠ+Ⅱ(n=9)5(55.6)551±22447.3±3.0Ⅲ+Ⅳ(n=21)19(90.5)*637±182*62.1±4.2*對照組(n=20)8(40.0)*#254±60*# 18.7±2.4*#

注：與Ⅰ+Ⅱ組比較，*P<0.05；與Ⅲ+Ⅳ組比較，#P<0.05

2.3 瘤體及血清VEGF與MVD相關性分析 經(jīng)Pearson直線相關分析，在瘤體組織中VEGF表達與MVD呈顯著正相關(r=0.672，P=0.00047)。但血清VEGF與MVD無相關性(r=0.095，P=0.619)。見圖1、2。

圖1 瘤體組織中VEGF表達與MVD呈正相關 圖2 瘤體和血清中VEGF表達與MVD無相關性

3 討論

腎母細胞瘤是多發(fā)于嬰幼兒的高度惡性胚胎源性腫瘤。手術切除是治療腎母細胞瘤的主要方法，由于起病隱匿，大部分患兒在就診時瘤體巨大而無法一期手術切除[2]。隨著新輔助化療在腎母細胞瘤治療中的應用，患兒的手術切除率及生存率得到了提高[3]。臨床工作中如何對腎母細胞瘤的分期和治療效果實施正確的監(jiān)測和評估，對于提高其療效和改善預后意義重大。

血管生成在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，而血管生成受多個血管生成調(diào)節(jié)因子的調(diào)控[4]。VEGF作為目前已知的活性最強、專屬性最高的血管生成因子，它選擇性作用于血管內(nèi)皮細胞特異性受體，主要發(fā)揮以下作用：誘導血管內(nèi)皮細胞增殖和新生血管形成，增加血管尤其是微小血管通透性，使血漿大分子外滲；刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生PAS蛋白，從而促使?jié)B漏到血管外區(qū)的血漿蛋白形成纖維蛋白凝塊，為新生血管提供生長基質(zhì)。

研究證明，VEGF在腎母細胞瘤的血管生成及腫瘤細胞的增殖過程中發(fā)揮著重要作用[5]。本研究通過對不同分期腎母細胞瘤瘤體及血清中VEGF的表達進行對比分析，發(fā)現(xiàn)臨床分期越高，腫瘤組織中VEGF表達越高；而血清中VEGF水平隨著臨床分期的提高亦隨之增高，這些結果表明腫瘤組織及血清中VEGF的表達均與腎母細胞瘤的臨床分期密切相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中VEGF表達和血清中的VEGF表達呈正相關(P<0.05)，因而推測腎母細胞瘤可能自身合成并分泌VEGF，導致血清VEGF水平升高。有研究表明，許多惡性腫瘤都存在VEGF過量產(chǎn)生,病期越晚以及轉(zhuǎn)移范圍越廣泛，血漿VEGF水平則越高[6]。腫瘤細胞分泌產(chǎn)生的VEGF可作用于相鄰基質(zhì)血管和淋巴管內(nèi)皮細胞VEGF受體，促進內(nèi)皮細胞分裂增殖，誘導血管和淋巴管新生，促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移[7]，這與本研究結果是一致的。因此認為可以通過檢測血清VEGF輔助推斷腎母細胞瘤大致臨床分期，指導治療。

本研究檢測了腎母細胞瘤組織中的MVD，發(fā)現(xiàn)Ⅲ+Ⅳ期MVD顯著高于Ⅰ+Ⅱ期，表明腫瘤分期越高，其新生血管就越多、血供越豐富，進而腫瘤生長就越快。同時，結果顯示在小兒瘤體組織中VEGF與MVD呈正相關，考慮為腫瘤細胞在生長過程中不斷分泌VEGF進而促使新生血管生成，新生的腫瘤血管加速腫瘤生長，在這種惡性循環(huán)的后期，腫瘤轉(zhuǎn)移的概率將大大增加。因此，臨床上應用抗血管生成劑打斷這一循環(huán)鏈，以抑制腫瘤的生長。它是抗VEGF的人源化單克隆抗體，通過抑制VEGF受體，促進細胞凋亡，抑制增殖，阻止腫瘤進展。

由此可見，瘤體中VEGF表達可反映腫瘤MVD；瘤體中VEGF表達及MVD以及血清中VEGF水平均可大致反映腫瘤分期；血清VEGF可能由腫瘤分泌。

1 Glade Bender JL,Lee A,Reid JM,et al.Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of pazopanib in children with soft tissue sarcoma and other refractory solid tumors:a children’s oncology group phase I consortium report.J Clin Oncol,2013,31:3034-3043.

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4 Ghanem MA,van der Kwast TH,Molenaar WM,et al.The predictive value of immunohistochemical markers in untreated Wilms’ tumour:are they useful? World J Urol,2013,31:811-816.

5 Glade Bender J,Yamashiro DJ,Fox E,et al.Clinical development of VEGF signaling pathway inhibitors in childhood solid tumors.Oncologist,2011,16:1614-1625.

6 Mabeta P.Decreased secretion of vascular endothelial growth factor is associated with increased apoptosis in vascular tumor derived endothelial cells.J Physiol Pharmacol,2013,64:473-477.

7 Sandoval JA,Malkas LH,Hickey RJ.Clinical significance of serum biomarkers in pediatric solid mediastinal and abdominal tumors.Int.J.Mol Sci,2012,13:1126-1153.

ClinicalsignificanceofdetectionofVEGFandMVDinnephroblastoma

WANGZhichao*,DIYuqin,ZHOUHui*,etal.*DepartmentofPediatricSurgery,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo investigate the significance of vascular endothelial growth factor (VEGF) and microvessel density (MVD) in pathogenesis of nephroblastoma.MethodsThirty specimens of nephroblastoma tissues including surgical resection,biopsy and serum of patients with nephroblastoma hospitalized from January 2006 to January 2013 were enrolled in the study,and these specimens were divided into I～IV stage groups and the other two groups (Ⅰ+Ⅱand Ⅲ+Ⅳ) according to NWTSG criteria (National Wilms’ Tumor Study Group),in which there were 4 cases at stage,5 cases at Ⅱ stage,18 cases at Ⅲ stage,3 cases at Ⅳstage.The expressions of VEGF and MVD in tumor tissue were detected by immunohistochemistry.The other 20 cases of nonnephroblastoma were selected as control group.ResultsThere were no significant differences in the expression levels of VEGF and MVD in tumor tissue of children patients among different age groups and between males and females (P>0.05). The expression levels of VEGF and MVD in tumor tissue at Ⅲ+Ⅳ stage were significant higher than those at Ⅰ+Ⅱstage (P<0.05). The expression of VEGF in tumor tissue was positively correlated with that of MVD (r=0.672,P<0.01).ConclusionThe expression of VEGF in tumor tissue can reflect the condition of MVD;the expression of VEGF,MVD in tumor tissue and serum can reflect the tumor stageing; sVEGF may be secreted from the tumors.

nephroblastoma;vascular endothelial growth factors; microvessel density;children;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.12.003

項目來源：河北省科學技術研究與發(fā)展指導計劃(編號：062761255)

050000 石家莊市，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院小兒外科(王志超、周輝、仲智勇、楊曉鋒、李索林)，小兒內(nèi)科(邸玉琴)

李索林，050000 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院小兒外科；

E-mail：lisuolin@263.net

R 692

A

1002-7386(2014)12-1769-03

2013-12-27)