★ 楊婕 徐桂香 黃多希 盧藝 許向群

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330004)

靈芝是一種保健和藥用價(jià)值很高的大型真菌，而黑靈芝被稱為靈芝中的極品，對(duì)人體保健功效，遠(yuǎn)比其它種類的靈芝高。靈芝多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等作用，還可作為腫瘤化療和放療的輔助治療。

膜分離技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)能、無污染，可在常溫下連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn),特別適用于熱敏性物質(zhì)的分離純化,該技術(shù)在化工、食品、生物、制藥等領(lǐng)域得到越來越廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。本課題組以江西贛南出產(chǎn)的黑靈芝為研究對(duì)象，利用靈芝多糖與其他成分分子量差異先采用微濾膜對(duì)靈芝浸提液進(jìn)行除雜，然后采用超濾技術(shù)，對(duì)靈芝水提物進(jìn)行分離，分離出不同分子量的靈芝多糖，為后期考察不同分子量段靈芝多糖的免疫增強(qiáng)活性，選擇純化具有免疫活性的靈芝多糖組分，以及靈芝多糖保健食品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，也為膜分離技術(shù)應(yīng)用于贛南黑靈芝多糖分離純化的產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材 贛南黑靈芝(采自江西贛南地區(qū))。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 葡萄糖(西隴化工股份有限公司)、氫氧化鈉(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)、重蒸苯酚(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)、濃硫酸(東莞市雙德化工有限公司)，均為分析純。

1.3 儀器設(shè)備 HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；BS214分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-ⅢB(浙江臨江市精工真空設(shè)備廠)；RE-5233型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV9100A紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、Megafugel.OR型高速大容量離心機(jī)(德國(guó)Thermo公司)；Millipore超濾儀；DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 贛南黑靈芝多糖的提取

2.1.1 贛南黑靈芝飲片的前處理 將贛南黑靈芝飲片洗凈，置潔凈托盤中鋪勻后放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在50℃的條件下干燥，待贛南黑靈芝飲片干燥至用手輕輕碾碎時(shí)即取出；再采用高速粉碎機(jī)對(duì)靈芝進(jìn)行破碎，并過60目篩。

2.1.2 贛南黑靈芝多糖的提取[2]熱水提取多糖時(shí)間1 h比較合適，時(shí)間太長(zhǎng)，可能引起糖結(jié)構(gòu)的變化和破壞，甚至使其中的五碳環(huán)或六碳環(huán)裂解，導(dǎo)致多糖的含量下降。熱水浸提的溫度也不宜過高，過高有可能破壞多糖的結(jié)構(gòu)。稱取適量靈芝粉末，然后加15倍質(zhì)量的水，在溫度90℃的條件下浸提2h。

2.2 贛南黑靈芝多糖的微濾膜除雜 將贛南黑靈芝多糖粗提取液用離心機(jī)在4000r/min，25℃條件下離心15min，取上清液。靈芝水提液中除了含有靈芝多糖外，還含有大分子的蛋白質(zhì)和一些雜質(zhì)，故選用微濾膜將靈芝水提液中的雜質(zhì)及大分子的蛋白質(zhì)除去。我們選用無機(jī)微濾膜N100和N30兩種不同型號(hào)的微濾膜對(duì)靈芝水提液進(jìn)行除雜，比較其效果，選擇更合適的一種。其工作條件為：進(jìn)口壓力0.26MPa，出口壓力0.14MPa、操作溫度60℃，流量為90L/min。靈芝多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

雜質(zhì)截留率采用公式：R=(1-Cp/Ci)×100%

式中：R為雜質(zhì)截留率；Cp為透過液中雜質(zhì)的濃度，(mg/L)；Ci為原液中雜質(zhì)的濃度，(mg/L)。

表1 微濾膜N100與N30的除雜效果表

用微濾膜進(jìn)行除雜試驗(yàn)時(shí)，每10 min測(cè)1次膜的通量。納濾膜N100與N30的通量衰減曲線見圖1。結(jié)果顯示，微濾膜N30和微濾膜N100除雜效果差別不大，除雜后固含物的差別也不大，但是微濾膜N100要高于N30的平均通量，從經(jīng)濟(jì)和效率角度考慮，選擇微濾膜N100更合適。

圖1 納濾膜N100與N30的通量衰減曲線

2.3 贛南黑靈芝多糖不同分子量段的超濾分離 組成靈芝多糖的單糖類型以葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖為主，還有少量巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、海藻糖等，少數(shù)多糖由單一葡萄糖組成。控制超濾壓力為0.08MPa，分別用分子截流量為100，30，10ku的超濾膜，將粗提物按分子量大

小分為>100ku(AGP1)、30～100ku(AGP2)、10～30ku(AGP3)和<10ku(AGP4)四部分，冷凍干燥，稱重，計(jì)算得率。

各分子量段多糖所占的百分比按下式計(jì)算:ω(%)=W1/W0×100。式中:W1為各分子量段多糖的質(zhì)量;W0為四部分多糖的質(zhì)量之和。

總糖含量測(cè)定：采用苯酚-硫酸法測(cè)定AGP1～AGP4中的總糖含量，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示在四段多糖中，分子量>100ku的部分(AGP1)所占比例最高，為41.66%，分子量為10～30ku的部分(AGP3)所占比例最低，約為1.04%，分子量為10～30ku的部分(AGP2)和分子量<10ku的部分(AGP4)所占比例分別為20.13%和27.72%。各分子量段多糖的總糖含量存在一定差異，AGP1的總糖含量最高，為52.77%，AGP4的總糖含量最低，為41.03%。

表2 各分子段多糖得率及總糖含量

4 結(jié)論

超濾技術(shù)作為一項(xiàng)新興的高效分離技術(shù)，是一個(gè)物理處理過程，具有操作簡(jiǎn)單，能耗少，工序簡(jiǎn)捷的特點(diǎn)，采用超濾分離得到四個(gè)不同分子量段的贛南黑靈芝多糖組分，總糖含量及單糖組成分析表明四者總糖含量存在一定差異。相關(guān)結(jié)果可為靈芝多糖類保健食品的工業(yè)開發(fā)提供理論支撐。

[1]高續(xù)春.多糖提取純化方法研究進(jìn)展[J].榆林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，19(4):65-67.

[2]張洪杰，王廣樂.贛南黑靈芝中多糖提取工藝的研究[J].江蘇科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，27(1)：80-84.

[3]董艷.膜分離提取純化中藥多糖的工藝研究[D].天津：天津大學(xué),2007.

[4]楊勇杰，姜瑞芝，陳英紅，等.苯酚-硫酸法測(cè)定雜多糖含量的研究[J].中成藥，2005,27(6)：706-708.

[5]張慶雷，周宏兵.膜分離技術(shù)及其在多糖分離純化研究中的應(yīng)用[J].食品與藥品，2009,11(5)：60-62.

[6]王湛.膜分離技術(shù)基礎(chǔ)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.