范世珍，莫 莉， 陳安彬

(深圳市福田區(qū)中醫(yī)院 檢驗(yàn)科,廣東 深圳518034)

宮頸癌的細(xì)胞學(xué)篩查靈敏度低。近年來，以人乳頭瘤病毒( HPV)為基礎(chǔ)的初篩或聯(lián)合檢測(cè)法日益受到重視[1，2]，與細(xì)胞學(xué)檢查相比，HPV檢測(cè)可簡(jiǎn)化樣本的收集過程，對(duì)于難以接觸的人群，可通過自行收集尿液樣本，從而為臨床篩查及疾病防治提供了條件。但迄今為止，尚沒有關(guān)于尿液以及宮頸或外陰分泌物標(biāo)本中HPV檢測(cè)的比較研究[3]。本研究通過比較尿液樣本和臨床醫(yī)生收集的外生殖器(外陰)和宮頸樣本中HPV，旨在為臨床上進(jìn)一步了解宮頸的疾病狀態(tài)提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究獲得本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。研究對(duì)象年齡18-41歲，各獲取140份尿液和宮頸分泌物標(biāo)本，以及132例外陰標(biāo)本。所有患者之前未行各種宮頸相關(guān)治療(如LEEP、冷刀、宮頸錐切術(shù)、冷凍療法和激光療法)。宮頸癌患者未行子宮切除術(shù)、化療或放射治療，或并發(fā)其他系統(tǒng)腫瘤。研究開始前簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本獲取

患者進(jìn)行盆腔檢查前，用無菌收集杯獲取第一杯尿液(含EDTA液)，后用Dacron拭子擦拭外陰尿道周圍后獲取分泌物標(biāo)本。對(duì)于宮頸標(biāo)本收集，窺陰器下采用Wallach broom獲取宮頸分泌物后送檢。

1.3 HPV檢測(cè)

取1 ml子宮頸或外陰標(biāo)本轉(zhuǎn)移到1.5 ml微量離心管中，12 000×g離心1 min，并用1 ml Hank平衡鹽溶液(HBSS)洗滌，棄Hank液，在200 μl新鮮HBSS中重懸沉淀細(xì)胞，使用DNA血液小提試劑盒提取DNA。DNA被洗脫于100 μl的水中，取10 μl洗脫的DNA用于線性陣列測(cè)定，其他的細(xì)胞沉淀儲(chǔ)存于-70℃?zhèn)溆?。?duì)于尿液標(biāo)本，采用Qiagen公司QIAamp DNA血液試劑盒提取DNA。按照試劑盒提供的步驟提取DNA用于線性陣列(Linear array)基因分型檢測(cè)HPV(Roche)。該方法可檢測(cè)HPV的37種基因型，包括13種致癌型(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68)和24個(gè)非致癌型HPV[4]。

1.4 檢測(cè)結(jié)果分析

根據(jù)尿液、外陰、宮頸標(biāo)本的線性陣列檢測(cè)結(jié)果計(jì)算致癌性HPV的總體一致性，陽性符合率和陰性符合率以及一致程度，同時(shí)，根據(jù)交叉分析法評(píng)估個(gè)別疾病分類的檢測(cè)陽性率。對(duì)病理確診宮頸上皮細(xì)胞等級(jí)2/3(CIN2/3)和CIN3，計(jì)算其敏感性、特異性、陰性、陽性預(yù)測(cè)值和Youden指數(shù)(敏感性+特異性-1)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，并采用χ2分析，區(qū)間估計(jì)均采用95% CI表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種標(biāo)本中HPV的檢出情況

140份尿液標(biāo)本中，至少可檢測(cè)出1種HPV基因型。而132例外陰標(biāo)本和140份宮頸標(biāo)本中，分別有94份和102份至少可檢測(cè)出1種HPV。其中13種致癌性HPV基因型中至少有1種基因型分別存在于82份尿液樣本(82/140，58.6%)，96份外陰標(biāo)本(96/132，72.7%) ，102份宮頸標(biāo)本(102/140，72.9%)。

2.2 各種標(biāo)本中HPV檢出率的一致性及相關(guān)性

宮頸分泌物和尿液共同陽性標(biāo)本78例，共同陰性標(biāo)本34例，宮頸分泌物陰性，尿液陽性標(biāo)本4例，尿液陰性、宮頸分泌物陽性24例，致癌性HPV在尿液和宮頸樣本的一致性是80%(112/140)。外陰分泌物和尿液共同陽性標(biāo)本74例，共同陰性標(biāo)本36例，外陰分泌物陰性，尿液陽性標(biāo)本2例，尿液陰性、外陰分泌物陽性20例，尿液與外陰樣本中的一致性為83.3%(110/132)。宮頸分泌物和外陰分泌物共同陽性標(biāo)本92例，共同陰性標(biāo)本28例，外陰分泌物陰性，宮頸分泌物陽性標(biāo)本4例，外陰標(biāo)本陽性、宮頸分泌物陰性8例，外陰和宮頸樣本中的一致性為90.9%(120/132)。尿液和宮頸標(biāo)本中致癌性HPV陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)，尿液和外陰樣本間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.40)，子宮頸和外陰樣本間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.52)。

2.3 各臨床標(biāo)本中致癌型HPV在不同宮頸病變中的檢出情況

138名婦女進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)分析。其中42例(30.4%)未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞或惡性細(xì)胞(NILM)，48例(34.8%)有未明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)，20例(14.5%)有低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)，28例(20.3%)有高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HGSIL)。組織學(xué)檢查包括30個(gè)無宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)，26個(gè)CIN2和18個(gè)CIN3，因此，組織學(xué)上44/138(31.8%)為 CIN2/3 和 18/138 (13%) 為 CIN3。

2.4 不同標(biāo)本中HPV的檢出率與不同組織學(xué)類型宮頸病變的關(guān)系

與組織學(xué)確診的CIN2/3相比，尿液中致癌性HPV臨床敏感度為81.8%(95% CI=69.4-92.2)，臨床特異性51.1%(95% CI=35.6-68.4)，116例外陰標(biāo)本進(jìn)行了組織學(xué)分析，其致癌性HPV檢出率的敏感性和特異性值分別為95.2% (95% CI=80.5-99.5) 和 40.5% (95% CI=25.8-57.5)，宮頸樣本的敏感度和特異度分別為95.5% (95% CI=81.2-99.7)和40.4% (95% CI=24.7-56.2)。各種標(biāo)本中HPV的敏感性或特異性差異(如宮頸與尿液、尿液與外陰)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05))，宮頸和外陰樣本檢測(cè)CIN3病變敏感性為100%，然而，尿液樣本CIN3的敏感性為88.9%(表1)。

3 討論

本研究通過對(duì)尿液中HPV的檢測(cè)以及對(duì)尿液、外陰和宮頸分泌物中HPV的基因分型，與宮頸病變程度進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，不管標(biāo)本為尿液、外陰還是宮頸分泌，致癌性HPV基因型在宮頸疾病級(jí)別越高，其檢出率越高。由于宮頸HPV與宮頸病變密切相關(guān)，因此，從尿液和外陰樣本對(duì)HPV的檢測(cè)，也可評(píng)估HPV誘導(dǎo)宮頸疾病成為可能。

表1 不同標(biāo)本中HPV和宮頸病變的關(guān)系

TP：真陽性；FN：假陰性；FP：假陽性；TN：真陰性；PPV：陽性預(yù)測(cè)值；NPV：陰性預(yù)測(cè)值。

一般而言，HPV常位于子宮頸和外生殖器部位，而很少出現(xiàn)在尿路[3，5]。因此，尿液中檢測(cè)到HPV說明病毒從子宮頸或其他外生殖器部位繼發(fā)剝脫，本研究發(fā)現(xiàn)尿液、外陰和宮頸病變組織中HPV基因型高度一致。但以尿液標(biāo)本中HPV比宮頸和外陰取樣中HPV的檢出率低，但特異性相對(duì)較高。大部分為CIN2/3以及CIN3的婦女能從尿液中準(zhǔn)確檢測(cè)出HPV，這說明，檢測(cè)CIN3靈敏度高達(dá)(88.9%)可能反映有潛在宮頸疾病。當(dāng)然，真實(shí)值的敏感性可能會(huì)受到一些其他因素(取樣和運(yùn)輸)的影響。我們證明不同標(biāo)本中HPV的基因型類似。如最常見的致癌性基因型均出現(xiàn)在宮頸、外陰和尿液取樣中，HPV16是最常見的基因型，但各取樣方法檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，在這3種標(biāo)本當(dāng)中，陰道上皮細(xì)胞非致癌性HPV基因型檢出率相似。至于外陰或陰道HPV取樣能否準(zhǔn)確反映宮頸HPV的基因譜，還需要更多的研究來證實(shí)。與宮頸或其他外生殖器取樣相比較，尿液取樣用于檢測(cè)致癌性HPV已經(jīng)在臨床和實(shí)驗(yàn)室得到了較為廣泛的研究。但于各研究當(dāng)中，不同的取樣方法、儲(chǔ)存條件、樣品制備、DNA提取和DNA擴(kuò)增均可影響HPV DNA檢測(cè)。此外，宮頸的病理學(xué)診斷目前被廣泛采用，因此通過尿液取樣檢測(cè)HPV用于臨床還有待進(jìn)一步開發(fā)。

總之，以尿液為基礎(chǔ)的取樣可能在篩查有更高風(fēng)險(xiǎn)患宮頸疾病的婦女是一種可行的方法。特別是對(duì)于無法進(jìn)行盆腔檢查患者，能減少冗繁的手工標(biāo)本采集，或者需要多次重復(fù)采樣時(shí)，大大降低了勞動(dòng)強(qiáng)度[6，7]。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果擴(kuò)大了以尿液取樣為基礎(chǔ)對(duì)宮頸癌篩查有效證據(jù)，這對(duì)于流行病學(xué)研究、疾病監(jiān)測(cè)、疫苗和臨床預(yù)防實(shí)驗(yàn)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Malik T,Reimer J,Gumel A,et al.The impact of an imperfect vaccine and pap cytology screening on the transmission of human papillomavirus and occurrence of associated cervical dysplasia and cancer[J].Math Biosci Eng,2013,10(4):1173.

[2]Ge S,Gong B,Cai X,et al.Prevent cervical cancer by screening with reliable human papillomavirus detection and genotyping[J].Cancer Med,2012,1(1):59.

[3]Smith GP.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science (New York,N.Y.),1985,228(4705):1315.

[4]Castle PE,Stoler MH,Wright TC Jr,et al.Performance of carcinogenic human papillomavirus (HPV) testing and HPV16 or HPV18 genotyping for cervical cancer screening of women aged 25 years and older:a subanalysis of the ATHENA study[J].Lancet Oncol,2011,12(9):880.

[5]Alameda F,Bellosillo B,Fuste P,et al.Human papillomavirus detection in urine samples:an alternative screening method[J].J Low Genit Tract Dis,2007,11(1):5.

[6]Cuschieri K,Nandwani R,McGough P,et al.Urine testing as a surveillance tool to monitor the impact of HPV immunization programs[J].J Med Virol,2011,83(11):1983.

[7]Soderlund-Strand A,Dillner J.High-throughput monitoring of human papillomavirus type distribution[J].Cancer epidemiology,biomarkers & prevention :a publication of the American.Association for Cancer Research,cosponsored by the American Society of Preventive Oncology,2013,22(2):242.