周芬芬，吳 湜，徐少華，黃海輝

艱難梭菌（Clostridium difficile）是醫(yī)院獲得感染性腹瀉最主要的病原菌，在抗生素相關性腹瀉中占20%～30%，而假膜性腸炎則幾乎90%以上均由艱難梭菌所致，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）。自2002年起北美和歐洲相繼發(fā)生100多次CDI暴發(fā)流行，主要與高產(chǎn)毒株核糖體型027有關［1］。當前北美仍以核糖體型027為最多見；歐洲2008年之后其他核糖體型如014／020、078等逐漸成為主要流行株［2］。國內(nèi)近年來對CDI亦越來越重視，Huang等［3］和陳云波等［4］報道CDI占醫(yī)院感染性腹瀉的9.5%～30.7%，但我國迄今為止尚未有核糖體型027感染的報道。

抗菌藥物的應用是CDI的最主要危險因素。艱難梭菌對多種抗菌藥物耐藥，在核糖體型027等高毒株的廣泛傳播中亦具重要作用［1］。Oka等［5］和Ilchmann等［6］報道艱難梭菌對克林霉素和紅霉素的耐藥率超過80%，對莫西沙星的耐藥率高達56%。國內(nèi)流行株核糖體型017對紅霉素、莫西沙星、克林霉素等抗菌藥物的耐藥率亦超過50%［7］。甲硝唑和萬古霉素迄今仍為治療CDI的一線藥物［8］，但近期亦有報道艱難梭菌對這2種藥物的敏感性有所下降［9］。本課題對復旦大學附屬華山醫(yī)院5年前后的艱難梭菌臨床分離株耐藥性和核糖體分型的變化進行了研究，為制定CDI的防治策略提供參考。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來源 收集2007年8月—2008年7月和2012年8月—2013年7月我院醫(yī)院獲得性腹瀉患者糞便中分別分離到的74株與64株艱難梭菌，經(jīng)革蘭染色及PCR擴增gluD基因陽性鑒定。剔除重復菌株。

（二）培養(yǎng)基及抗菌藥物 CCFA（頭孢甲氧噻吩－環(huán)絲氨酸－果糖－瓊脂）選擇培養(yǎng)基為英國OXIOD公司產(chǎn)品；Brucella瓊脂培養(yǎng)基為美國BD公司產(chǎn)品；抗菌藥物包括甲硝唑、萬古霉素、紅霉素、莫西沙星、夫西地酸、左氧氟沙星、克林霉素、四環(huán)素、利福平和亞胺培南為美國Sigma－aldrich公司產(chǎn)品。

（三）主要儀器及試劑 細胞毒素中和試驗試劑盒為美國Techlab公司產(chǎn)品；Concept 400厭氧工作站為英國Ruskinn公司產(chǎn)品，多重實時聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction ，PCR）儀 為 美 國Cepheid公司產(chǎn)品；HotStarTaq Master Mix試劑盒為德國QIAGEN公司產(chǎn)品。

二、方法

（一）毒素檢測 采用普通PCR檢測tcdA基因，多重實時PCR檢測tcdB、cdtA、cdtB基因。另以細胞毒中和試驗對毒素B加以確證。

（二）核糖體分型和多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 采用 PCR 核糖體分型法［10］對所有分離到的產(chǎn)毒株進行分型。PCR核糖分型圖譜參照英國公共衛(wèi)生實驗室厭氧菌參考實驗室 ［Public Health Laboratory Services （PHLS）Anaerobic Reference Unit，Cardiff］標準菌株圖譜（部分）。如圖譜與標準菌株圖譜一致，則按標準株核糖體型命名，例如核糖體型027；反之則以英文字母如 A、B、C、等順序分型［7］。部分菌株采用Stabler等［11］推薦的方法測定 MLST，以7個管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi）作 為 目 標測序基因，在www.mlst.net網(wǎng)站上進行分析，得出序列型。

（三）抗菌藥物敏感性試驗 按CLSI推薦的瓊脂稀釋法測定10種抗菌藥物對艱難梭菌的MIC。藥敏試驗培養(yǎng)基采用Brucella瓊脂添加5 mg／L血紅素，1 mg／L維生素K以及5%脫纖維羊血。按CLSI 2011年版M11－A8推薦艱難梭菌瓊脂稀釋法接種菌液為107CFU／mL，接種菌量為104CFU／點［12］。37℃厭氧培養(yǎng)48 h。按 CLSI 2007年版M11－A7以及2013年版M100－S23標準判讀藥敏試驗結(jié)果。CLSI無確切判斷標準藥物的耐藥折點，按文獻［13－14］報道：萬古霉素≥32 mg／L；紅霉素≥8 mg／L；利福平≥4 mg／L；左氧氟沙星≥8 mg／L；夫西地酸＞0.5 mg／L。質(zhì)控菌株為艱難梭菌ATCC700057和脆弱擬桿菌ATCC 25285。對3類以上不同化學結(jié)構(gòu)的抗菌藥物耐藥的菌株為多重耐藥株。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件計算 MIC50和 MIC90。

結(jié) 果

一、毒素與核糖體分型

2007年8月—2008年7月與2012年8月—2013年7月分別獲得74株與64株艱難梭菌產(chǎn)毒株。5年前分離到的74株菌中，23株僅產(chǎn)B毒素（A－B＋，31.1%），49株產(chǎn) A、B兩種毒素（A＋B＋，66.2%），2株同時產(chǎn)A、B兩種毒素和二元毒素（A＋B＋CDT＋，2.7%）。74株菌分別屬于18個核糖體型，以核糖體型017（A－B＋，24.3%）最為常見。5年后的64株臨床分離株中，22株為A－B＋，占34.4%；42株為A＋B＋，占65.6%。共檢測到18個核糖體型，以核糖體型 H（A－B＋，18.8%）最為常見，其次為核糖體型017和012，見表1。H型菌株MLST結(jié)果為ST－81型。

二、藥敏試驗分析

138株艱難梭菌對抗菌藥物的敏感性見表2。所有菌株對甲硝唑和萬古霉素均呈高度敏感。2012—2013年臨床分離株中，分別有26.6%、67.2%、65.6%和28.1%的菌株對莫西沙星（MIC≥32 mg／L）、紅霉素（MIC＞128 mg／L）、克林霉素（MIC＞128 mg／L）和四環(huán)素（MIC≥32 mg／L）呈高度耐藥；32.8%（21／64）的菌株同時對紅霉素、克林霉素、莫西沙星和四環(huán)素呈多重耐藥，其中81.0%（17／21）的多重耐藥菌株屬于核糖體 H型（12／21）和017型（5／21）。與5年前相比，艱難梭菌臨床分離株對克林霉素耐藥率由74.3%升至84.4%、對四環(huán)素由39.2%升至48.4%、對夫西地酸由25.7%升至35.9%，耐藥率呈升高趨勢，并出現(xiàn)了亞胺培南耐藥株；但對左氧氟沙星和利福平的耐藥率則出現(xiàn)下降趨勢，分別由78.4%和20.3%降至47.4和7.8%。同時5年后多重耐藥株（32.8%）的比率亦高于5年前（28.3%）。

表1 艱難梭菌臨床分離株5年前后的毒素類別及核糖體分型Table 1 Ribotypes and toxin profiles of clinical Clostridium difficile isolates during two periods with an interval of 5 years

表2 比較10種抗菌藥物對艱難梭菌5年前后臨床分離株的最低抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentrations（MICs）of 10 antimicrobial agents against the Clostridium difficile isolates during two periods with an interval of 5 years

討 論

雖然A＋B＋菌株在艱難梭菌感染中仍占主導地位，但是A－B＋菌株感染的報道亦非少見。歐洲和美國艱難梭菌臨床分離株仍以A＋B＋菌株為主，A－B＋菌株總分離率為1%～3%［2，15］；但日本和韓國的艱難梭菌A－B＋產(chǎn)毒株臨床分離率則上升至12.7%～21.4%［16－17］，我 國陳云 波等［4］和章黎華等［18］報道A－B＋產(chǎn)毒株占所有分離產(chǎn)毒株的34.0%～37.5%。亞洲國家A－B＋菌株的分離率明顯高于歐美國家，有可能與核糖體型017（A－B＋）菌株在亞洲國家的流行有關［2，7，15］。本研究中臨床分離株雖然總體來說以A＋B＋菌株為多見，但A－B＋菌株亦約占30%，與陳云波等［4］報道相仿。因此在國內(nèi)醫(yī)院的檢驗科若僅檢測A毒素將有約1／3 CDI患者可能漏診。

盡管核糖體型027菌株過去數(shù)年中在北美與歐洲廣泛流行，但是亞洲的相關報道仍比較少，僅韓國、新加坡、日本與我國香港有零星報道。另一新流行株核糖體型078，在荷蘭2005—2008年其分離率從3%迅速增長到13%，但本研究并未檢測到。我院2007年8月—2008年7月艱難梭菌臨床分離株以核糖體型017為主，5年后則以H型最多見，占18.8%。H型菌株MLST分型為ST－81型，與核糖體017型／ST－37具有較高的同源性［11］，且兩者的毒素類別均為A－B＋。2012年上海中山醫(yī)院曾在腹瀉伴血流感染患者的糞便和血液中均分離到艱難梭菌，經(jīng)檢測這2株菌核糖體分型同為H型，提示該型菌株不僅導致腹瀉，而且能引起更為嚴重且罕見的血流感染。

甲硝唑和萬古霉素體外對艱難梭菌具有良好抗菌活性，耐藥株罕見。然而2008年Peláez等［19］報道西班牙一所醫(yī)院艱難梭菌臨床分離株中12%菌株對甲硝唑呈異質(zhì)性耐藥，本課題組在前期也有類似報道［20］。但2012—2013年并未在分離到的新鮮菌株中檢測到異質(zhì)性耐藥菌。與5年前相比，當前艱難梭菌臨床分離株對多種抗菌藥物的耐藥率有所增高，其中對克林霉素、四環(huán)素、夫西地酸的耐藥率約增高10個百分點，且對紅霉素、克林霉素、莫西沙星和四環(huán)素耐藥的多重耐藥菌的比率亦上升至32.8%。耐藥率的升高原因之一可能與近2年核糖體型017和 H型在醫(yī)院內(nèi)的流行相關（20／64，31.3%），因這2種類型的細菌多呈多重耐藥；其次可能與抗生素選擇性壓力有關［21－22］，例如2007年我院多西環(huán)素和亞胺培南－西司他丁的用量分別為200DDDs和2 205.5DDDs，至2012年分別上升至2 896DDDs和3 675.8DDDs。

近10年來，艱難梭菌作為一種條件致病菌在感染性疾病中的重要性日漸增加。應重視CDI的檢測，建議對急性醫(yī)院獲得性腹瀉患者，特別是近3個月內(nèi)曾經(jīng)接受過抗菌藥物治療者送檢糞便標本，一旦確診應立即隔離診治，并合理應用抗菌藥物，嚴格掌握適應證，避免盲目使用廣譜抗菌藥物對于降低艱難梭菌感染的發(fā)病和傳播亦極為重要。

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