鄒自英，韓 黎，熊 杰，盧中一，孟祥兆，張雨龍，趙靜雅，韓雪琳，田曙光，陳 勇

2.解放軍疾病預(yù)防控制所醫(yī)院感染監(jiān)控中心；

3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；

4.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院。

金葡菌是一種重要的人類(lèi)病原菌，可引起血流感染、皮膚軟組織感染、肺炎、心內(nèi)膜炎等。醫(yī)院和社區(qū)獲得性耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染的流行和傳播，以及導(dǎo)致的患者高病死率，已在全世界范圍引起廣泛關(guān)注。spa分型技術(shù)是基于葡萄球菌蛋白A基因多態(tài)性發(fā)展的分型技術(shù)，只需對(duì)單個(gè)基因片段測(cè)序，適用于研究由金葡菌感染引起的短期暴發(fā)流行、醫(yī)院內(nèi)傳播及長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。本研究主要采用spa分型方法，對(duì)金葡菌臨床分離菌株進(jìn)行分型分析，旨在獲取金葡菌的流行菌株和耐藥信息，從而為控制MRSA和甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）的傳播提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

一、菌株來(lái)源

2011年5—11月成都某醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)金葡菌56株，標(biāo)本來(lái)源傷口拭子18株、痰液15株、血液9株、膿液5株、其他來(lái)源9株（包括尿液、胸水、腹水、關(guān)節(jié)液等）。所有菌株采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的菌種凍存管－80℃留存。

二、菌株的鑒定和藥敏試驗(yàn)

采用法國(guó)生物梅里埃公司的BacT／Alert3D全自動(dòng)血液培養(yǎng)儀進(jìn)行血培養(yǎng)，VITEK2 compact全自動(dòng)微生物分析儀及GP鑒定卡對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，AST－GP67藥敏卡檢測(cè)菌株的藥物敏感性，結(jié)果按2012年 CLSI M100－S22［1］判斷。AST－GP67檢測(cè)的抗菌藥物有青霉素、苯唑西林、克林霉素、紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素、利福平、甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑、呋喃妥因、環(huán)丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、喹奴普?。_(dá)福普汀、利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、替加環(huán)素。質(zhì)控菌株為金葡菌ATCC29213和ATCC25923，購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

三、DNA提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒［A1120，普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司］的說(shuō)明書(shū)提取所有金葡菌的DNA。取2μL DNA作為以下PCR反應(yīng)的模板。

四、mecA基因和pvl基因檢測(cè)

mecA基因和pvl基因的檢測(cè)參照文獻(xiàn)中的報(bào)道［2－3］，mecA 基因擴(kuò)增引物序列為：mecA＿F：5’－AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC－3’mecA＿R：5’－AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC－3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度532 bp；pvl基因引物序列為：PVL＿F：5’－ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA－3’，PVL＿R：5’－GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC－3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度433 bp。PCR反應(yīng)體系50μL，10μmol／L上下游引物各2μL，按照試劑說(shuō)明書(shū)（DR001B，大連寶生物工程有限公司）加入dNTP mix、rTaq酶和10×PCR Buffer，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至50μL。擴(kuò)增參數(shù)均為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，出現(xiàn)特異性條帶鑒定為mecA基因或pvl基因陽(yáng)性。

五、spa分型

spa分型PCR擴(kuò)增引物和反應(yīng)體系參照http：／／www.seqnet.org網(wǎng)站，引物序列為：spa－1113F： 5’－TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC－3’，spa－1514R：5’－CGGCAGTAGTGCCGTTTGCTT－3’。PCR反應(yīng)體系與前面一致。擴(kuò)增參數(shù)：80℃預(yù)熱5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min。按照DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)（DP214，北京天根生物技術(shù)有限公司）對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所生物信息分析室進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序儀器為3730XL型。使用Bionumerics 6.6軟件對(duì)spa基因測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)序列的排列方式確定型別。根據(jù)http：／／www.seqnet.org網(wǎng)站提供的spa分型與多位點(diǎn)序列分型（MLST）和所屬克隆群（clone complex，CC）的對(duì)應(yīng)關(guān)系，確定主要spa型別菌株可能關(guān)聯(lián)的ST型和所屬CC。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用頻數(shù)、構(gòu)成比、百分比對(duì)分類(lèi)變量資料進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)或精確概率法對(duì)分類(lèi)變量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。分析軟件為SPSS 16.0。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、藥敏試驗(yàn)和mecA基因檢測(cè)

根據(jù)苯唑西林藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，56株金葡菌中包括21株 MRSA（37.5%）和35株 MSSA（62.5%）。56株金葡菌對(duì)萬(wàn)古霉素、替加環(huán)素、利奈唑胺、喹奴普丁－達(dá)福普汀、呋喃妥因全部敏感，只有1株MSSA對(duì)青霉素敏感。MRSA對(duì)利福平、左氧氟沙星、莫西沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素和四環(huán)素等抗菌藥物的敏感率低于 MSSA，見(jiàn)表1。21株MRSA中mecA 基因陽(yáng)性20株 （95.2%），35株MSSA均為mecA基因陰性。

二、spa分型

21株MRSA的spa型別數(shù)有6種，以t030（66.7%）為主，標(biāo)本來(lái)源主要為痰液和血液。35株MSSA的型別數(shù)有18種，以t189、t377和t034列前3，分別占14.3%、14.3%和11.4%，標(biāo)本來(lái)源以傷口分泌物為主，見(jiàn)表2。發(fā)現(xiàn)MSSA中包括一種新的spa分型new1，其重復(fù)序列為26－12－21－17－13－13－34－34－34－33－13，分離自1例男性患者的膿液標(biāo)本。未發(fā)現(xiàn)具有相同spa分型的MRSA和MSSA菌株。

三、殺白細(xì)胞毒素（PVL）檢測(cè)

65株金葡菌中pvl基因陽(yáng)性5株（7.7%），包括1株MRSA和4株MSSA，其中來(lái)自患者組織、尿液和鼻拭子各1株，傷口拭子2株。5株P(guān)VL陽(yáng)性菌株spa分型為 MSSA－t189（3株）、MRSA－t287（1株）和 MSSA－t796（1株）。

表1 56株金葡菌對(duì)抗菌藥物的敏感率（%）Table 1 Susceptibility of 56 clinical isolates of Staphylococcus aureus to selected antimicrobial agents（%）

表2 MRSA和MSSA的spa分型及標(biāo)本來(lái)源情況Table 2 spatyping and specimen source of methicillin－resistant and methicillin－susceptible Staphylococcus aureus strains

討 論

金葡菌尤其是MRSA具有多部位感染和多藥耐藥性質(zhì)，是醫(yī)院感染重要病原菌之一，與HBV及AIDS并列世界三大難解決的感染性疾病。mecA基因的存在是MRSA耐β內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的主要原因之一［4］。本研究1株 MRSA mecA基因陰性，但苯唑西林MIC≥4 mg／L，原因可能為非mecA介導(dǎo)的苯唑西林耐藥。與MSSA相比，MRSA對(duì)利福平、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素和慶大霉素的敏感率顯著降低（P＜0.05），文獻(xiàn)報(bào)道與mecA基因的表達(dá)有關(guān)［5］。MRSA的高耐藥率仍是臨床面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果顯示，萬(wàn)古霉素、利奈唑烷、替加環(huán)素、喹奴普?。_(dá)福普汀和呋喃妥因?qū)RSA的抗菌活性最高，未檢出耐藥株，但已有文獻(xiàn)報(bào)道異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金葡菌（hVISA）［6］，實(shí)驗(yàn)室要加強(qiáng)對(duì)金葡菌糖肽類(lèi)抗菌藥物耐藥性的檢測(cè)。

金葡菌蛋白A是細(xì)胞壁的組成成分之一，編碼蛋白A的基因長(zhǎng)約2 150 bp，包括Fc結(jié)合區(qū)、X區(qū)和C末端，X區(qū)含有2～15個(gè)長(zhǎng)21～27 bp的重復(fù)序列，X區(qū)由于重復(fù)序列數(shù)目、特征和排列順序不同而具有高度的多態(tài)性，利用這種基因的多態(tài)性建立的分型方法為spa分型，具有快速、易于操作、重復(fù)性好的特點(diǎn)，適用于金葡菌感染的常規(guī)調(diào)查。本研究發(fā)現(xiàn)臨床MRSA的主要型別是t030，與文獻(xiàn)報(bào)道的t030為我國(guó)主要的流行克隆型之一結(jié)果一致［7］，t030不僅在我國(guó)廣泛分布，也是挪威、德國(guó)、荷蘭、瑞士、瑞典等國(guó)家的主要流行克隆型。MRSA－t030對(duì)應(yīng)的ST型有ST239和ST246，其對(duì)各種臨床常用抗菌藥物的耐藥性高，對(duì)喹諾酮類(lèi)3種抗菌藥物和氨基糖苷類(lèi)慶大霉素全部耐藥，可能是其能廣泛傳播的原因之一，但所有MRSA－t030菌株均對(duì)甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑敏感。文獻(xiàn)報(bào)道的我國(guó)另一主要流行克隆型t037［7］，本研究只檢出1株。本研究檢出2株t437，屬于典型的社區(qū)獲得性MRSA，但均為PVL陰性。本地區(qū)除t030和t037外，還報(bào)道過(guò)t008［8］。

有關(guān)MSSA基因分型的研究報(bào)道較少，李克誠(chéng)等［9］對(duì)3株MSSA的分型結(jié)果顯示，分別為t377和t304。本研究結(jié)果顯示，MSSA的克隆型分布較分散，共檢出18個(gè)克隆型，以t189、t377和t034列前3，主要來(lái)自傷口感染。3株MSSA－t189為pvl陽(yáng)性，與既往報(bào)道的社區(qū)獲得性菌株表現(xiàn)一致［10］，而MSSA－t034為與牲畜相關(guān)CC398存在相關(guān)性的菌株［11］。由此提示部分社區(qū)獲得性MSSA存在克隆傳播，并成為醫(yī)院和社區(qū)人群出現(xiàn)皮膚與軟組織感染的重要原因。本研究檢出1個(gè)spa重復(fù)序列和分型數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.ridom.de／spaserver）未命名的新克隆型，暫時(shí)稱(chēng)作new1。

明確流行環(huán)節(jié)、切斷傳播途徑、終止耐藥菌株在醫(yī)院和社區(qū)中的傳播是感染控制的重要策略之一，而掌握金葡菌的分子特征對(duì)于有效控制感染和鑒別菌株之間是否存在相關(guān)性至關(guān)重要。本研究的MRSA呈現(xiàn)高度的克隆一致性，提示MRSA在醫(yī)院內(nèi)的傳播流行，而spa分型技術(shù)是監(jiān)控金葡菌感染的方便快速的手段。本研究雖然僅部分代表了成都地區(qū)金葡菌的分子流行病學(xué)情況，但是為金葡菌的臨床治療、感染控制和暴發(fā)流行監(jiān)測(cè)提供了重要參考。

［1］ Clinical and Laboratory Standads Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing［S］.Twenty－second informational supplement，2012，M100－S22.

［2］ Murakami K，Minamide W，Wada K，et al.Identification of methicillin－resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaction［J］.J Clin Microbiol，1991，29（10）：2240－2244.

［3］ Lina G，Piemont Y，Godail－Gamot F，et al.Involvement of Panton－Valentine leukocidin－producing Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia［J］.Clin Infect Dis，1999，29（5）：1128－1132.

［4］ 姜愛(ài)英，應(yīng)俊，管瑜，等.臨床分離金黃色葡萄球菌mecA和qacA／B基因檢測(cè)［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20（9）：1212－1215.

［5］ 章敏，都莉，謝憶虹，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和溶血葡萄球菌耐藥基因的檢測(cè)［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19（22）：3014－3016.

［6］ 田銳，許宏濤，柳宏，等.異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌在心內(nèi)科病房血流感染中的研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23（4）：721－723.

［7］ Liu Y，Wang H，Du N，et al.Molecular evidence for spread of two major methicillin－resistant Staphylococcus aureus clones with a unique geographic distribution in Chinese hospitals［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53（2）：512－518.

［8］ 李囡，范紅，陳慧莉，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌基因分型研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（15）：2122－2126.

［9］ 李克誠(chéng)，李瓊，夏菲，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌spa基因分型［J］.疾病監(jiān)測(cè)，2012，27（11）：877－880.

［10］ Ghaznavi－Rad E，Nor Shamsudin M，Sekawi Z，et al.Predominance and emergence of clones of hospital－acquired methicillin－resistant Staphylococcus aureus in Malaysia［J］.J Clin Microbiol，2010，48（3）：867－872.

［11］ Zhao C，Liu Y，Zhao M，et al.Characterization of community acquired Staphylococcus aureus associated with skin and soft tissue infection in Beijing：high prevalence of PVL＋ST398［J］.PLoS One，2012，7（6）：e38577.