占景華，石鶴坤，鐘淵福，董智聰，胡永獅*

0 引言

他克莫司(Tacrolimus,FK-506)最早由日本藤澤藥品工業(yè)公司探索研究所于1984年自日本筑波山土壤中分離的筑波鏈霉菌(Streptomyces tsskibaensis)NO9993的發(fā)酵液中提取，是含氮23元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類強(qiáng)效免疫抑制劑[1]。目前，已廣泛應(yīng)用于肝臟、胰腺、腎臟、心臟和肺等實(shí)體器官移植后的抗排異治療，其藥理作用是有效抑制T細(xì)胞激活，與內(nèi)源性細(xì)胞受體(FKBP12)結(jié)合形成一個(gè)親免素immunophilins復(fù)合物，從而發(fā)揮藥理作用[2]。

由于他克莫司是一種上市不久的新型免疫抑制劑，所以關(guān)于他克莫司膠囊的檢測(cè)方法報(bào)道相對(duì)較少，為了保證他克莫司膠囊的微生物限度檢測(cè)法的準(zhǔn)確性和可靠性，減少患者健康潛在的危害，保證在生產(chǎn)、貯存、銷售過程中的質(zhì)量，現(xiàn)按照2010版《中國(guó)藥典》二部附錄微生物限度檢查法有關(guān)規(guī)定[3]，通過系列試驗(yàn)，考察了他克莫司膠囊的抑菌活性和微生物檢查法，并建立適合于該制劑的微生物限度檢查方法，為制劑的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品 他克莫司膠囊分別由杭州中美華東制藥有限公司(批號(hào)：13401，樣品1)、安斯泰來(lái)制藥有限公司(批號(hào)：OD5606A，樣品2)、浙江海正藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：20130311，樣品3)提供。

1.2 驗(yàn)證用菌種 枯草桿菌CMCC 63202-4a(第三代)，金黃色葡萄球菌CMCC 26003-28(第三代)，大腸埃希菌CMCC 44102-22(第三代)，白色念珠菌CMCC(F)98001(第三代)，黑曲霉CMCC(F)98003(第三代)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、真菌瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基和甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基均由中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，按使用說(shuō)明書配制。

1.4 設(shè)備 ES-315全自動(dòng)滅菌鍋(TOMY)、SW-CJ-1FD醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州康萊特凈化工程有限公司)、ZW-2008集菌儀(溫州維科生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、KBF220一次性使用集菌過濾培養(yǎng)器(溫州維科生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(THERMO)。

2 方法

2.1 菌液制備 分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h后，分別取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養(yǎng)物1 mL+9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至106～107，細(xì)菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，做活菌計(jì)數(shù)備用。

接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，經(jīng)23～28 ℃培養(yǎng)24～48 h后，取白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 mL+9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至104～107，菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，做活菌計(jì)數(shù)備用。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)23～28 ℃培養(yǎng)5～7 d后，取黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液1 mL +9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至104，菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.2 供試液制備 稱取樣品5 g，加0.5%吐溫80蛋白胨水氯化鈉緩沖液至45 mL，作為1∶10供試液。

2.3 回收率測(cè)定(平皿計(jì)數(shù)法)

2.3.1 常規(guī)法 試驗(yàn)組：取1∶10供試液1 mL、50～100個(gè)/mL試驗(yàn)菌液1 mL同時(shí)加入平皿中，立即傾注15～20 mL溫度不超過45 ℃的培養(yǎng)基中，待凝固后，置培養(yǎng)基觀察結(jié)果，同時(shí)平行3個(gè)平皿。供品對(duì)照：取1∶10供試液各1 mL分別加入至平皿中，立即傾注15～20 mL溫度不超過45 ℃的培養(yǎng)基，待凝固后，置培養(yǎng)觀察結(jié)果。稀釋劑對(duì)照：取稀釋液1 mL替代供試品，加入50～100個(gè)試驗(yàn)菌，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。

2.3.2 0.2 mL/皿稀釋法 取1∶10的供試液1 mL分注于5個(gè)平皿(即0.2 mL/皿)中，于每皿中分別加入1 mL含有50～100個(gè)的試驗(yàn)菌，立即傾注45 ℃相應(yīng)的培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備3個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。

2.3.3 薄膜過濾法 試驗(yàn)組：每管分別取已制成的1∶10供試液10 mL，全量過濾(蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速160 r/min)，用無(wú)菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗500 mL或1 L，等瓶底留沖洗液20 mL左右時(shí)，分別加入各試驗(yàn)菌液1 mL，混勻，過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果或25 ℃ 72 h觀察結(jié)果。稀釋劑對(duì)照組：取稀釋劑各100 mL，分別加入上述試驗(yàn)菌，使菌濃度為50～100 cfu/mL，按試驗(yàn)組的方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。供試品對(duì)照組：按試驗(yàn)組方法處理，但不加菌液。

2.3.4 計(jì)算方法 試驗(yàn)組的菌回收率(%)=[(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%

3 結(jié)果

3.1 他克莫司膠囊微生物檢測(cè)回收率(常規(guī)法)(1∶10) 他克莫司膠囊3個(gè)樣品常規(guī)平皿培養(yǎng)法微生物限度檢查的驗(yàn)證結(jié)果見表1。從表1可以看出：采用常規(guī)方法檢驗(yàn)他克莫司膠囊供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率試驗(yàn)均低于70%，有一定抑菌作用，不能采用常規(guī)方法檢驗(yàn)。根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，確定他克莫司膠囊微生物限度檢查法為細(xì)菌數(shù)和霉菌數(shù)測(cè)定均不能采用常規(guī)方法檢驗(yàn)。

表1 他克莫司膠囊微生物檢測(cè)回收率(常規(guī)法)(1∶10)

3.2 他克莫司膠囊微生物檢測(cè)回收率(常規(guī)法)0.2 mL稀釋法 他克莫司膠囊3個(gè)樣品稀釋法0.2 mL/皿微生物限度檢查的驗(yàn)證結(jié)果見表2。從表2可以看出：采用稀釋法0.2 mL/皿檢驗(yàn)他克莫司膠囊供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對(duì)枯草桿菌的回收率高于70%；而對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率試驗(yàn)均低于70%，有一定抑菌作用，不能采用稀釋法0.2 mL/皿檢驗(yàn)。根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，確定他克莫司膠囊微生物限度檢查法為細(xì)菌數(shù)和霉菌酵母菌數(shù)測(cè)定均不能采用稀釋法0.2 mL/皿檢驗(yàn)。

表2 他克莫司膠囊微生物檢測(cè)回收率(常規(guī)法)0.2 mL稀釋法

3.3 他克莫司膠囊微生物檢測(cè)回收率(薄膜過濾法1∶10，沖洗500 mL) 他克莫司膠囊3個(gè)樣品薄膜過濾法(1∶10)微生物限度檢查的驗(yàn)證結(jié)果見表3。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，他克莫司膠囊微生物限度檢查菌落計(jì)數(shù)采用薄膜過濾法供試液1∶10，沖洗500 mL，除黑曲霉外，試驗(yàn)組的各試驗(yàn)菌回收率均在70%以上。

表3 他克莫司膠囊微生物檢測(cè)回收率(薄膜過濾法1∶10，沖洗500 mL)

3.4 他克莫司膠囊微生物檢測(cè)回收率(薄膜過濾法1∶100、1∶1 000，沖洗500 mL) 見表4、表5。表4結(jié)果顯示，采用薄膜過濾法供試液1∶100；沖洗500 mL，供試品對(duì)黑曲霉回收率低于70%。表5結(jié)果顯示，采用薄膜過濾法供試液1∶1 000；沖洗500 mL，供試品對(duì)黑曲霉回收率高于70%。

表4 他克莫司膠囊微生物檢測(cè)回收率(薄膜過濾法1∶100，沖洗500 mL)

表5 他克莫司膠囊微生物檢測(cè)回收率(薄膜過濾法1∶1 000，沖洗500 mL)

4 結(jié)論

微生物限度方法驗(yàn)證是確認(rèn)供試品在所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用，以保證供試品污染的微生物能被充分檢驗(yàn)出來(lái)[4]。藥物具有抑菌成分的進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，要求供試品本身在試驗(yàn)的條件下有效排除其抑菌作用，使其在不干擾染菌的限度檢驗(yàn)，結(jié)果方屬有效[5]。

他克莫司膠囊按照2010年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法驗(yàn)證方法驗(yàn)證，結(jié)果如下，細(xì)菌總數(shù)：取供試品5 g，加無(wú)菌0.5%吐溫80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至45 mL，振搖混勻，制成1∶10供試液；取供試液1 mL，全量過濾(蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速160 r/min)，用無(wú)菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 mL沖洗，取出濾膜菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)菌落。霉菌和酵母菌：另取1∶10供試液1 mL，加入到100 mL的無(wú)菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，取1 mL，全量過濾(蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速160 r/min)，用無(wú)菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 mL沖洗，取出濾膜菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)72 h，計(jì)數(shù)菌落。

在菌落計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證中，大腸埃希菌代表革蘭陰性菌，金黃色葡萄球菌代表革蘭陽(yáng)性菌，枯草芽孢桿菌代表芽孢桿菌，白色鏈球菌代表酵母菌，黑曲霉代表霉菌，因此，該驗(yàn)證方法較能體現(xiàn)出檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，減少檢測(cè)方法誤差[6-7]。建議不同檢測(cè)樣品進(jìn)行微生物限度檢測(cè)都必須進(jìn)行方法驗(yàn)證，避免采用單一常規(guī)法或膜過濾法進(jìn)行微生物限度檢測(cè)，使實(shí)驗(yàn)科學(xué)合理，提高工作效率，更加規(guī)范性。

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