章 亮,周 暉,陳小會(huì)

0 引言

難治性復(fù)發(fā)性急性髓系白血病(Refractory and relapse acute myeloid leukemia，rrAML)是成人惡性血液疾病的主要類型，預(yù)后較差。藥物聯(lián)合化療仍是rrAML的主要治療手段[1]。當(dāng)前rrAML的化療方案主要有米托蒽醌+依托泊苷+阿糖胞苷(Mitoxantrone+etoposid+cytarabine,MEA)方案及氟達(dá)拉濱+阿糖胞苷+重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(Fludaraine+cytarabine+recombinant human granulocyte colony stimulating factor,FLAG)方案，但臨床仍缺乏兩種方案治療rrAML療效及安全性的系統(tǒng)性比較及評(píng)價(jià)。本研究對(duì)rrAML患者分別按照MEA、FLAG方案化療，比較兩種化療方案的療效及安全性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年6月至2013年6月在本院治療的rrAML患者68例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合《惡性血液病診治和療效標(biāo)準(zhǔn)》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)、骨髓形態(tài)學(xué)、染色體、融合基因檢查確診；②按標(biāo)準(zhǔn)方案誘導(dǎo)治療2個(gè)療程后無(wú)效，或第1次完全緩解后在6～12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)(早期復(fù)發(fā))及12個(gè)月后復(fù)發(fā)(晚期復(fù)發(fā))，或復(fù)發(fā)≥2次；③體能狀態(tài)(ECOG)≤2分；④簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重心、肝、肺疾病或惡性腫瘤；②合并嚴(yán)重感染或代謝性疾??；③首次發(fā)病的AML患者；④其他類型的白血病患者；⑤M3型AML；⑥已發(fā)展至晚期，無(wú)治愈希望者。將68例患者采用SPSS 17.0產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為2組，每組34例，兩組年齡、性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、復(fù)發(fā)病程、分型等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較(例，%)

1.2 化療方法 MEA組按照MEA方案化療。米托蒽醌(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：65271809)靜脈滴注，10 mg/d，第1～3天；阿糖胞苷[上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司華聯(lián)制藥廠，批號(hào):147944]靜脈滴注，100～150 mg/(m2·d)，第1～7天；依托泊苷(四川三精升和制藥有限公司，批號(hào)：33419420)靜脈滴注，100 mg/d，第1～5天。

FLAG組按照FLAG方案化療。氟達(dá)拉濱(揚(yáng)州奧賽康藥業(yè)有限公司，批號(hào)：75607679)靜脈滴注，50 mg/d，第1～5天；阿糖胞苷[上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司華聯(lián)制藥廠，批號(hào):147944]靜脈滴注，100 mg/(m2·d)，第1～5天；重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(齊魯制藥廠，批號(hào)：135968091)皮下注射，300 μg/d，第0～5天。

兩組在按上述化療方案治療基礎(chǔ)上，均給予地西他濱 20 mg/(m2·d)，qd×(5～9)d去甲基化治療，維持1 h以上。在化療期間對(duì)癥給予水化、堿化、保護(hù)臟器、漱口、坐浴、止吐、抗感染等治療。兩組均化療1個(gè)療程后評(píng)價(jià)療效。

1.3 觀察指標(biāo) 在化療期間嚴(yán)密監(jiān)測(cè)血常規(guī)、凝血功能、電解質(zhì)、肝腎功能，并進(jìn)行心電圖、胸部CT、腹部超聲、骨髓穿刺等檢查，記錄感染、敗血癥、粒細(xì)胞缺乏及腹瀉、發(fā)熱、口腔炎等非血液學(xué)毒副反應(yīng)發(fā)生情況?；?個(gè)周期結(jié)束后，次日根據(jù)臨床表現(xiàn)、血象、骨髓象評(píng)價(jià)化療效果。化療效果評(píng)價(jià)參考《惡性血液病診治和療效標(biāo)準(zhǔn)》分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、未緩解(NR)，總緩解=CR+PR。

1.4 ID4基因甲基化檢測(cè) 化療前均收集兩組患者骨髓以備用。取兩組中CR患者化療前及化療后的骨髓標(biāo)本，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MS-PCR)、Methylight-PCR對(duì)ID4基因甲基化進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。

1.4.1 MS-PCR檢測(cè) ①引物設(shè)計(jì)：ID4基因甲基化特異性引物參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度186 bp。②PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)總體積25 μL，包含上游、下游引物各25 pmol/L，2×GoTaqGreen master mix 12.5 μL，模板DNA 2 μL，補(bǔ)充無(wú)菌雙蒸水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；隨后經(jīng)72 ℃延伸7 min完成擴(kuò)增。

1.4.2 Methylight-PCR檢測(cè) ①引物設(shè)計(jì)：MYOD1作為內(nèi)參基因，引物及探針參考文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。②PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)總體積20 μL，包含ID4基因甲基化特異性引物及探針各50 pmol，2×EpiTectMethylight Master mix 10 μL，補(bǔ)充無(wú)菌雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s；于60 ℃進(jìn)行FAM熒光收集。

通過(guò)-△Ct=-(Ct甲基化-Ct內(nèi)參)計(jì)算ID4基因甲基化水平，-△Ct越大ID4基因甲基化程度越高[4]。

2 結(jié)果

2.1 化療效果 經(jīng)過(guò)1個(gè)療程化療后，F(xiàn)LAG組總緩解率為70.95%，高于MEA組的52.94%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 不良反應(yīng)發(fā)生情況 兩組化療后敗血癥、非血液學(xué)毒性反應(yīng)發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FLAG組侵襲性真菌病、粒細(xì)胞缺乏發(fā)生率高于MEA組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。FLAG組感染性發(fā)熱、粒細(xì)胞缺乏持續(xù)時(shí)間分別為(8.72±2.01)d、(20.44±3.50)d，長(zhǎng)于MEA組的(6.55±1.78)d、(18.27±2.87)d，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=2.80，t2=3.32,P均<0.05)。

表2 兩組治療效果比較(例，%)

表3 兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較(例，%)

2.3 化療前、后ID4基因甲基化水平 MEA組經(jīng)化療后7例達(dá)CR，F(xiàn)LAG組10例達(dá)CR，兩組CR患者化療前ID4基因甲基化水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，化療后FLAG組CR患者ID4基因甲基化水平低于MEA組的CR患者，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 兩組CR患者化療前、后ID4基因甲基化水平比較

3 討論

AML約占成人白血病的75%，多耐藥細(xì)胞株的產(chǎn)生使得AML治療反復(fù)失敗，并發(fā)展成為rrAML[5]。異基因造血干細(xì)胞移植是目前治療rrAML最有效的方法，但此前的再誘導(dǎo)緩解仍然需要化療藥物實(shí)現(xiàn)。目前臨床治療rrAML的化療藥物主要是大劑量的阿糖胞苷聯(lián)合二線藥物、二線藥物聯(lián)合化療或聯(lián)合靶向治療新藥等，其中以MEA、FLAG等方案化療較為常見(jiàn)，但臨床仍缺乏兩種方案治療rrAML的療效及安全性的系統(tǒng)性評(píng)價(jià)。

余丹等[6]研究發(fā)現(xiàn)，MEA與FLAG治療1個(gè)療程后，總緩解率分別為61.14%、64.38%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而治療2個(gè)療程后，F(xiàn)LAG方案組總緩解率為82.34%，高于MEA方案組的66.13%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但FLAG方案組骨髓抑制發(fā)生率高于MEA方案組，持續(xù)時(shí)間也較長(zhǎng)。Takami等[7]研究也得到相似結(jié)論，米托蒽醌、依托泊苷與阿糖胞苷較少發(fā)生交叉耐藥，毒副反應(yīng)較少，但治療1～2個(gè)療程后，總緩解率不如FLAG方案高。本研究中，經(jīng)1個(gè)療程化療后，F(xiàn)LAG組總緩解率為70.95%，高于MEA組的52.94%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與余丹等報(bào)道基本相符，提示FLAG方案治療rrAML效果優(yōu)于MEA。兩種化療方案中均應(yīng)用大劑量阿糖胞苷。阿糖胞苷是作用于細(xì)胞周期S期的特異性藥物，其療效主要依賴于癌細(xì)胞內(nèi)活性成分單磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)的濃度，劑量越大其直達(dá)癌細(xì)胞細(xì)胞核中的濃度就越大，對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用越大[8]。Claus等[9]研究發(fā)現(xiàn)，氟達(dá)拉濱可協(xié)同阿糖胞苷,使阿糖胞苷在rrAML中的Ara-CTP濃度增加2～7倍，同時(shí)氟達(dá)拉濱對(duì)耐藥的細(xì)胞有直接毒性作用，抑制癌細(xì)胞DNA修復(fù)，增強(qiáng)癌細(xì)胞殺傷作用。而近年研究也發(fā)現(xiàn)，重組人粒細(xì)胞集落刺激因子可使0期癌細(xì)胞進(jìn)入S期，提高阿糖胞苷的化療敏感性[10]。這也許是FLAG方案治療rrAML療效優(yōu)于MEA方案的主要原因。

值得注意的是，阿糖胞苷對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用具有劑量依賴性，其對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用也呈劑量依賴性。雖然FLAG治療rrAML的總緩解率更高，但感染與骨髓抑制發(fā)生率也顯著升高。葛健等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)rrAML患者按FLAG方案化療1個(gè)療程后，粒細(xì)胞缺乏、感染發(fā)生率分別達(dá)50.03%、59.35%，非血液學(xué)毒副反應(yīng)發(fā)生率也較高，但程度均較輕。本研究中，F(xiàn)LAG組將阿糖胞苷的劑量適當(dāng)調(diào)低，為100 mg/(m2·d)，低于MEA組的150 mg/(m2·d)，化療后感染、粒細(xì)胞缺乏發(fā)生率分別為47.06%、52.94%，略低于葛健等報(bào)道水平，但仍高于MEA組，且持續(xù)時(shí)間也長(zhǎng)于MEA組。此外，國(guó)外學(xué)者研究認(rèn)為，F(xiàn)LAG方案的骨髓抑制作用不僅與阿糖胞苷有關(guān)，還可能與氟達(dá)拉濱有關(guān)。Fedele等[12]對(duì)rrAML采用FLAG方案誘導(dǎo)，隨后采用去氟達(dá)拉濱方案鞏固，結(jié)果66%以上的患者仍采集到足夠的CD34+細(xì)胞。而以FLAG方案誘導(dǎo)，以去阿糖胞苷為鞏固方案，結(jié)果又有69%以上的患者未采集到足夠的CD34+細(xì)胞。因此Fedele等認(rèn)為，氟達(dá)拉濱會(huì)損傷患者的造血干細(xì)胞，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

AML的發(fā)病與發(fā)展與基因缺失、突變密切相關(guān)。人體ID4基因甲基化與實(shí)體瘤，如直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，在非霍奇金淋巴瘤、AML中檢測(cè)到ID4基因甲基化提示有復(fù)發(fā)可能[9,13-14]。這些研究提示：靶向誘導(dǎo)抑癌基因的表達(dá)有可能成為AML治療的新途徑。楊華等[15]研究報(bào)道，在23例rrAML患者中，14例檢出ID4基因甲基化陽(yáng)性，陽(yáng)性率為60.87%，給予地西他濱等去甲基化藥物化療后，ID4基因甲基化水平顯著下降。本研究對(duì)兩組患者分別按MEA、FLAG治療基礎(chǔ)上給予去甲基化藥物地西他濱治療，化療后ID4基因去甲基化水平均有所下降，但FLAG組ID4基因去甲基化水平下降更明顯。于錦香等[16]研究發(fā)現(xiàn)，地西他濱單藥化療的CR率為60.13%，地西他濱聯(lián)合CAG化療的CR率為72.96%。蔡成森等[14]也得到相似結(jié)論，地西他濱聯(lián)合AAG方案化療的療效優(yōu)于地西他濱。上述研究得出一個(gè)結(jié)論，其他化療藥物有可能提高地西他濱的去甲基化功能。本研究中，F(xiàn)LAG組經(jīng)化療后，ID4基因甲基化水平顯著低于MEA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示FLAG方案對(duì)地西他濱去甲基化的增強(qiáng)作用優(yōu)于MEA，這可能也是FLAG方案治療效果優(yōu)于MEA方案的一個(gè)原因，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Sepehrizadeh Z,Mohammadi M,Emami A,et al.Assessment of cytokine expression profile in acute myeloid leukemia patients before and after chemotherapy[J].Turk J Haematol,2014,31(2):149-154.

[2] 林鳳茹,郭曉楠,任金海.惡性血液病診治和療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第2版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2009:216-240.

[3] 劉洋,康慧媛,王莉莉,等.急性白血病細(xì)胞中ID4基因甲基化的PCR定量檢測(cè)系統(tǒng)的建立及其特異性和敏感性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2014,22(2):269-274.

[5] Aref S,Sharawy SE,Sabry M,et al.Wilms tumor 1 gene mutations in patients with cytogenetically normal acute myeloid leukemia[J].Turk J Haematol,2014,31(2):143-148.

[5] Kim H,Lee JH,Joo YD.Prospective,Multicenter,Phase Ⅱ study on reducing the dosage of idarubicin and FLAG for patients younger than 65 years with resistant acute myeloid leukemia:a comparison with a higher dosage trial[J].Acta Haematol,2014,132(1):87-96.

[6] 余丹,張念,易雪,等.FLAG和MEA方案治療難治復(fù)發(fā)性急性髓系白血病療效分析[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2013,28(11):1076-1077.

[7] Takami A,Yano S,Yokoyama H,et al.Donor lymphocyte infusion for the treatment of relapsed acute myeloid leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation:A retrospective analysis by the Adult AML Working Group of the Japan Society for Hematopoietic Cell Transplantation[J].Biol Blood Marrow Transplant,2014,14(7):112-120.

[8] 郭智,何學(xué)鵬,陳惠仁,等.不同劑量阿糖胞苷維持治療對(duì)老年急性髓系白血病預(yù)后的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥,2012,7(11):1388-1390.

[9] Claus R,Wilop S,Hielscher T,et al.A systematic comparison of quantitative high-resolution DNA methylation analysis and methylation-specific PCR[J].Epigenetics,2012,7(7):772-780.

[10]王萍,葛守輩,劉曉娟,等.重組人白細(xì)胞介素-11治療急性髓系白血病化療后血小板減少效果觀察[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2014,28(3):301-302.

[11]葛健,曾慶曙,楊明珍,等.CAG與FLAG方案治療難治或復(fù)發(fā)急性髓系白血病的療效初步研究[J].安徽醫(yī)學(xué),2012,33(3):268-270.

[12]Fedele R,Messina G,Martinello T,et al.Tolerability and efficacy of busulfan and fludarabine as allogeneic pretransplant conditioning therapy in acute myeloid leukemia:comparison with busulfan and cyclophosphamide regimen[J].Clin Lymphoma Myeloma Leuk,2014,11(7):215-221.

[13]劉秉珊,郭緒濤,查潔,等.急性髓系白血病MDR1和BAALC基因表達(dá)水平及其預(yù)后意義的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(21):1691-1695.

[14]蔡成森,孫愛(ài)寧,仇惠英,等.地西他濱單藥及聯(lián)合AAG方案治療初治急性髓系白血病的臨床觀察[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2012,6(19):6092-6094.

[15]楊華,朱海燕,姜孟孟,等.地西他濱治療骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病的臨床觀察[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2013,21(1):121-125.

[16]于錦香,蔡冬梅,王曉雪,等.地西他濱聯(lián)合CAG治療老年急性髓系白血病的療效觀察[J].實(shí)用藥物與臨床,2013,16(3):211-213.