李 玲， 崔金暉， 陳新娟， 范建輝

(中山大學附屬第三醫(yī)院產科，廣東 廣州 510630)

胎膜早破(premature rupture of membranes，PROM)是指臨產前的胎膜破裂，分為足月胎膜早破(term premature rupture of membranes，TPROM)和未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membranes，PPROM)。其中PPROM占分娩量的1%～2%，占早產病因的30%～40%[1]，增加新生兒呼吸窘迫綜合癥、新生兒感染、腦室內出血、壞死性小腸結腸炎的發(fā)生率，文獻報道有1%～2%的新生兒死亡[2]。并且PROM的潛伏期越長，孕婦的剖宮產率及絨毛膜羊膜炎的發(fā)生率均有增加趨勢[3]。對于PROM，根據2013年ACOG最新指南[4]，臨床的基本處理是終止妊娠或監(jiān)測相關指標和促胎肺成熟期待妊娠至34周,尚無明確的預防和治療方法。對于如何保護和治療PROM尤其是PPROM顯得尤為重要。研究表明，TPROM和PPROM胎膜組織、母血、羊水中基質金屬蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表達高于正常足月妊娠組[5]。近幾年國外對胎膜組織的體外培養(yǎng)研究表明抗氧化劑對胎膜組織具有一定的保護作用[6-8]。為探討在體外抗氧化劑是否對破裂的胎膜組織也具有一定的保護作用，及比較不同抗氧化劑的保護強度，本實驗體外培養(yǎng)破裂的胎膜組織，采用免疫組化染色法和Western blotting技術檢測相應處理后胎膜組織MMP-9的表達量，進一步探討和比較不同抗氧化劑對胎膜早破孕婦胎膜組織的作用。

材 料 和 方 法

1 研究對象

選取2013年在中山大學附屬第三醫(yī)院產科因PROM住院剖宮產分娩的孕婦(診斷標準參照2013年ACOG指南[4])，均未臨產，其中TPROM(37～39周)和PPROM(28～37周)各4例(排除內外科合并癥和外傷等誘因，孕婦要求剖宮產)。胎盤娩出后無菌操作下在宮頸破膜口處收集胎膜破裂組織3塊，每塊組織約3 cm×3 cm大小，用PBS沖洗去除血液和羊水，分別置于含DMEM培養(yǎng)基(5%雙抗、0.2%水解乳蛋白)的無菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2)，3個培養(yǎng)皿中分別加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)(即對照組)、0.5 mmol/L α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,α-LA)和28.8 g/L 維生素C(vitamin C，Vit C)+1.8 g/L維生素E(vitamin E，Vit E)體外培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后用PBS充分沖洗后每塊胎膜組織分成兩部分，一部分胎膜組織用甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋備HE染色和免疫組化染色用，另一部分用液氮保存用于Western blotting的檢測。

2 試劑和設備

2.1試劑 兔抗人MMP-9單克隆抗體(Abcam)，兔抗人β-actin單克隆抗體(Abcam)，羊抗兔多克隆抗體IgG HRP(Abcam)。PVDF膜(Millipore)，三步法SA-HRP兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(北京康為世紀)。

2.2設備 Leica RM2025型石蠟切片機(Leica)；正置熒光顯微鏡(Leica)；Image-Pro Plus圖片分析軟件(Media Cybernetics)；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(Bio-Rad)；凝膠圖片曝光及分析儀AlphaView SA(Protein Simple)。

3 免疫組化對MMP-9的表達進行定位和半定量分析

各組中的胎膜組織經甲醛固定、脫水、透明及石蠟包埋后切片。切片脫蠟、乙醇復水、蒸餾水洗滌。3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶活性，EDTA 8.0修復液高壓修復2 min，10%山羊血清室溫封閉10 min。甩干后滴加兔抗人MMP-9單克隆抗體(稀釋度為1∶30)，4 ℃孵育過夜(陰性對照由PBS代替I抗)。PBS沖洗后滴加生物素標記羊抗兔Ⅱ抗工作液常溫孵育10 min，PBS充分沖洗，再滴加HRP標記的鏈霉親和素工作液常溫孵育10 min。PBS沖洗后二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，雙盲閱片，在光學顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×400)，Leica顯微鏡攝像系統攝像，Image-Pro Plus圖像分析系統測定陽性表達物的積分吸光度值(integral absorbance，IA)。以IA值(IA=陽性積分吸光度/陽性表達面積)代表MMP-9的表達水平。

4 Western blotting測定MMP-9的表達

應用碾磨體液氮下碾磨胎膜組織，蛋白提取液提取組織總蛋白。3組胎膜組織分別取總蛋白為80 μg，10%SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白質，然后將蛋白轉移至硝酸纖維素濾膜上,用5%脫脂奶粉封閉2 h。加入稀釋度為1∶2 000兔抗人MMP-9單克隆抗體4 ℃過夜。以兔抗人β-actin(1∶1 000)作內參照。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(稀釋度為1∶2 000)，室溫孵育1 h。洗滌后用新鮮配制的ECL化學發(fā)光液顯影，AlphaView SA機自動曝光和進行條帶灰度值掃描，掃描結果進行統計學處理,每例組織重復3次。

5 統計學處理

應用SPSS 13.0統計分析軟件處理，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 免疫組化對各組胎膜組織中MMP-9表達的定位和半定量分析

1.1TPROM組織中各組MMP-9蛋白的表達 免疫組化結果顯示，在TPROM組織中，分別加入PBS、α-LA和Vit C+Vit E后，3組中均有MMP-9的表達，主要表達于絨毛膜細胞及中性粒細胞的胞漿中。且3組棕黃色的陽性面積相差不大，IA值分別為：0.0133±0.0040、0.0077±0.0088和0.0071±0.0058,差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. Localization of MMP-9 in TPROM tissues detected by immunohistochemical staining.

1.2PPROM組織中各組MMP-9蛋白的表達 免疫組化結果顯示，在PPROM組織中，分別加入PBS、α-LA和Vit C+Vit E后，3組中均有MMP-9的強陽性表達，除在絨毛膜細胞和中性粒細胞胞漿中表達外，在羊膜上皮細胞的胞漿中也表達。且加入抗氧化劑后MMP-9的表達量均出現下調，以Vit C+Vit E組最顯著。3組的IA值分別為0.0618±0.0098、0.0212±0.0057和0.0107±0.0009，組間差異顯著(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. Localization of MMP-9 in PPROM tissues detected by immunohistochemical staining.

2 Western blotting對各組胎膜組織中MMP-9蛋白表達的定量分析

2.1TPROM組織中各組MMP-9蛋白的表達 Western blotting結果顯示，在TPROM組織中，分別加入PBS、α-LA和Vit C+Vit E后，3組中的pro-MMP-9(92 kD)和active MMP-9(78 kD)蛋白的相對表達水平分別為0.99±0.03/0.99±0.22、0.94±0.07/0.64±0.07和1.10±0.16/0.28±0.13。加入抗氧化劑后active MMP-9表達量均出現下調,差異均有統計學意義(P<0.05)。且Vit C+Vit E組和α-LA組比較，前者active MMP-9表達量更低，差異有統計學意義(P<0.05)。3組中pro-MMP-9(92 kD) 的表達量差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

Figure 3. Protein levels of MMP-9 in TPROM tissues detected by Western blotting.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs control；△P<0.05 vs α-LA.

2.2PPROM組織中各組MMP-9蛋白的表達 Western blotting結果顯示,在PPROM組織中，分別加入PBS、α-LA、Vit C+Vit E后，3組中的pro-MMP-9和active MMP-9蛋白的相對表達水平分別為1.00±0.20/1.00±0.10、0.69±0.08/0.35±0.07和0.38±0.03/0.16±0.05。加入抗氧化劑后pro-MMP-9和active MMP-9蛋白表達量均出現下調,差異均有統計學意義(P<0.05)。且Vit C+Vit E組與α-LA組比較，前者pro-MMP-9和active MMP-9表達量更低(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. Protein levels of MMP-9 in PPROM tissues detected by Western blotting.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs control；△P<0.05 vs α-LA.

討 論

胎膜早破的發(fā)病是多因素、多途徑共同相互作用的結果?，F在的研究一致認為胎膜本身結構的改變是胎膜早破發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[9]，而組成胎膜細胞外基質的各種膠原蛋白是維持胎膜的強度及完整性的主要決定因素,其中Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白在基底膜和細胞外基質中占有重要地位。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)被激活后能降解細胞外基質的膠原蛋白成分，研究最多的是MMP-2和MMP-9[10]，MMP-2和MMP-9主要降解Ⅳ型膠原蛋白。研究發(fā)現[11-13]足月妊娠中胎膜破裂處的MMP-9蛋白的表達及活性均比未臨產宮頸處的MMP-9明顯升高，且分娩發(fā)動后羊水中MMP-9活性也明顯升高，PROM患者MMP-9在宮頸處胎膜中的濃度也比其它地方高，且胎膜組織中IV型膠原含量下降明顯，與MMP-9的上升具有相關性，提示MMP-9不僅參與了正常分娩過程中胎膜的破裂，也參與了胎膜早破的發(fā)生。既往大量的研究，學者一直提出胎膜早破與ROS相關的學說。在與胎膜早破相關的病因中，感染、Vit C缺乏、出血、吸煙、可卡因的使用[14]，均與活性氧(reactive oxygen species，ROS)密切相關。馬秀菊等[15]和肖文霞等[16]做了大量的關于胎膜早破和氧化應激的研究，發(fā)現胎膜早破孕婦血清、蛻膜組織、胎膜組織中氧化應激指標丙二醛升高，超氧化物歧化酶、Vit E均降低。PPROM孕婦的血清Vit C濃度也比正常孕婦低[17]，提示Vit C可能參與了PPROM的發(fā)生。如果PROM和ROS存在密切的關系，抗氧化劑應該能夠對這種氧化應激的連鎖反應起一定的阻斷作用。研究表明[6-8]，體外實驗發(fā)現抗氧化劑能夠抑制凝血酶、TNF-α、HOCl對胎膜組織的損傷。動物實驗也發(fā)現鳥類每天口服300 mg/kg α-LA后，血清、肝臟以及肌肉中脂質過氧化物標志物丙二醛的濃度較對照組顯著降低，提高體內的抗氧化能力和抑制氧化應激反應[18]。既往大量的研究在于發(fā)現抗氧化劑能夠預防胎膜組織的損傷，本實驗在此基礎上進一步探討抗氧化劑對破裂的胎膜組織是否也具有保護和治療作用？本實驗采用28.8 g/L Vit C+ 1.8 g/L Vit E的劑量是根據動物實驗在缺氧環(huán)境下能夠保護胎兒心臟的劑量[19]，而0.5 mmol/L α-LA是能夠保護體外培養(yǎng)的胎膜組織減少受TNF-α和IL-1β損傷的劑量[6]。本研究Western blotting結果顯示破裂的胎膜組織加入抗氧化劑α-LA或Vit C+Vit E后， active MMP-9的表達量均下調，在PPROM組織中，pro-MMP-9的蛋白表達也出現了明顯的下調(P<0.05),結果進一步說明了體外抗氧化劑對胎膜組織有保護作用。

上述研究的結果均提示胎膜早破和氧化應激有密切的聯系，抗氧化劑不僅能夠預防胎膜組織的損傷，還能夠對破裂的胎膜組織也具有一定的保和治療作用。胎膜早破發(fā)生后，ROS仍存在連鎖的瀑布式反應，及時給予抗氧化劑后可清除ROS，減少凝血酶、TNF-α和細胞因子等的分泌，減少MMP-9的活化和細胞外Ⅳ型基質膠原蛋白的破壞和降解，避免胎膜組織進一步的重構和變性，有利于破膜處傷口的愈合。本實驗結果表明在0.5 mmol/L α-LA或28.8 g/L Vit C+ 1.8 g/L Vit E的作用劑量下， Vit C+Vit E的保護和治療作用強于α-LA(P<0.05)。因為Vit C與α-LA相比較，除具有抗氧化性能外，還參與膠原蛋白的合成及分泌，Vit C是合成賴氨酸羥化酶和脯氨酸羥化酶的輔因子，對于維持膠原蛋白三維螺旋結構穩(wěn)定的羥賴氨酸和羥脯氨酸的合成至關重要[20]。Vit C還具有促進Vit E循環(huán)利用的功能，具有協同作用。Vit E的主要作用是預防細胞內外脂質過氧化作用，減少ROS對膜的損傷。Vit C和Vit E同時使用的效果更優(yōu)于Vit C的單獨使用。

本實驗還采用了免疫組化染色方法對MMP-9蛋白進一步定位, TPROM組織中MMP-9主要定位于絨毛膜細胞和中性粒細胞的胞漿中，PPROM組織中MMP-9除在絨毛膜細胞和中性粒細胞的胞漿中表達外，在羊膜上皮細胞的胞漿中也強陽性表達，提示PPROM組織損傷更為嚴重，MMP-9表達更為廣泛。免疫組化對MMP-9的半定量分析結果和Western blotting結果基本相一致。免疫組化結果中，在TPROM胎膜組織中3組間MMP-9(pro-MMP-9和active MMP-9)差異無統計學意義(P>0.05)，可能因為pro-MMP-9表達無顯著差異導致MMP-9(pro-MMP-9和active MMP-9)差異無統計學意義。

綜上所述，本實驗結果進一步證實胎膜早破和ROS的密切相關，抗氧化劑對于破裂的胎膜組織也具有一定的保護和治療作用，但具體的作用機制尚需要進一步研究和臨床實驗的證實。28.8 g/L Vit C+ 1.8 g/L Vit E的保護作用明顯優(yōu)于0.5 mmol/L α-LA，可能與Vit C參與膠原蛋白的合成相關，也有可能與α-LA的劑量不夠有關。至于具體多大劑量的α-LA和Vit C+Vit E才能夠更好地預防和治療胎膜早破以及α-LA+ Vit C+Vit E聯合用藥是否會發(fā)揮更好的作用有待進一步的研究。

[參 考 文 獻]

[1] Mercer BM. Preterm premature rupture of the membranes[J]. Obstet Gynecol,2003,101(1):178-193.

[2] ACOG Committee on Practice Bulletins-Obstetrics. ACOG Practice Bulletin No. 80: premature rupture of membranes. Clinical management guidelines for obstetrician-gynecologists[J]. Obstet Gynecol,2007,109(4):1007-1019.

[3] 李 玲，吳金芝，李 萍，等. 未足月胎膜早破潛伏期對母嬰結局的影響[J].中山大學學報,2013,34(4):590-595.

[4] Practice Bulletins No. 139: premature rupture of membranes[J]. Obstet Gynecol, 2013， 122(4): 918-930.

[5] 范建輝，崔金暉，滕奔琦，等. MMP-9和iNOS在胎膜早破胎膜組織中的表達及相關性研究[J].中國病理生理雜志,2011,27(10):2000-2004.

[6] Moore RM, Novak JB, Kumar D, et al. Alpha-lipoic acid inhibits tumor necrosis factor-induced remodeling and weakening of human fetal membranes[J]. Biol Reprod,2009,80(4):781-787.

[7] Moore RM, Schatz F, Kumar D, et al. Alpha-lipoic acid inhibits thrombin-induced fetal membrane weakeninginvitro[J]. Placenta,2010,31(10):886-892.

[8] Plessinger MA, Woods JJ, Miller RK. Pretreatment of human amnion-chorion with vitamins C and E prevents hypochlorous acid-induced damage[J]. Am J Obstet Gynecol,2000,183(4):979-985.

[9] Oyen ML, Calvin SE, Landers DV. Premature rupture of the fetal membranes: is the amnion the major determinant?[J]. Am J Obstet Gynecol,2006,195(2):510-515.

[10] Romero R, Chaiworapongsa T, Espinoza J, et al. Fetal plasma MMP-9 concentrations are elevated in preterm premature rupture of the membranes[J]. Am J Obstet Gynecol,2002 ,187(5):1125-1130.

[11] Chai M, Walker SP, Riley C, et al. Effect of supracervical apposition and spontaneous labour on apoptosis and matrix metalloproteinases in human fetal membranes[J]. Biomed Res Int, 2013. 2013: 316146.

[12] Maymon E, Romero R, Pacora P,et al. Evidence ofinvivodifferential bioavailability of the active forms of matrix metalloproteinases 9 and 2 in parturition, spontaneous rupture of membranes, and intra-amniotic infection[J]. Am J Obstet Gynecol, 2000, 183(4): 887-894.

[13] Oh KJ, Park KH, Kim SN, et al. Predictive value of intra-amniotic and serum markers for inflammatory lesions of preterm placenta[J]. Placenta,2011,32(10):732-736.

[14] Menon R, Fortunato SJ, Yu J, et al. Cigarette smoke induces oxidative stress and apoptosis in normal term fetal membranes[J]. Placenta,2011,32(4):317-322.

[15] 肖文霞，馬秀菊. 胎膜早破孕婦血清MDA、SOD、VE的測定及意義[J]. 國外醫(yī)學(婦幼保健分冊),2005,16(4):201-202.

[16] 馬秀菊，肖文霞. 氧化應激與胎膜早破的相關性研究[J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志,2006,14(1):69-70.

[17] Osaikhuwuomwan JA, Okpere EE, Okonkwo CA, et al. Plasma vitamin C levels and risk of preterm prelabour rupture of membranes[J]. Arch Gynecol Obstet, 2011, 284(3): 593-597.

[18] Chen P, Ma QG, Ji C, et al. Dietary lipoic acid influences antioxidant capability and oxidative status of broilers[J]. Int J Mol Sci, 2011， 12(12): 8476-8488.

[19] Tan S, Liu YY, Nielsen VG, et al. Maternal infusion of antioxidants (Trolox and ascorbic acid) protects the fetal heart in rabbit fetal hypoxia[J]. Pediatr Res, 1996, 39(3): 499-503.

[20] American College of Obstetricians and Gynecologisis. ACOG Practice Bulletin No. 120: use of prophylactic antibiotics in labor and delivery[J]. Obstet Gynecol, 2011, 117(6): 1472-1483.