刁翔文， 李 娟， 劉俊茹， 黃蓓暉， 李 瀅

(中山大學附屬第一醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510080)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性克隆性漿細胞疾病，常合并有出凝血功能異常，容易并發(fā)出血或動、靜脈血栓[1]。MM出凝血異常與多種因素相關(guān)，如M蛋白水平、基因、內(nèi)皮細胞損傷、凝血因子VIII(factor VIII，F(xiàn)VIII)和血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)升高、纖溶異常和化療藥物等[2]。

MM治療目前有許多新藥，例如硼替佐米、沙利度胺、來那度胺等。其中免疫調(diào)節(jié)劑沙利度胺或來那度胺通過增強組織因子和血管內(nèi)皮生長因子的表達、下調(diào)凝血酶敏感蛋白、誘導細胞因子介導的活化蛋白C抵抗等機制影響MM的出凝血功能，促進血栓形成[3]。蛋白酶體抑制劑硼替佐米對MM出凝血系統(tǒng)的作用目前尚不清楚，但多項臨床研究顯示采用硼替佐米聯(lián)合其它化療藥物治療的MM患者，血栓發(fā)生率小于5%[4]。

微顆粒(microparticles，MPs)是一類細胞受刺激后形成的膜性小囊泡，有促凝、促炎癥、促使血管生成、調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能等作用[5]。最近對于血栓性疾病的研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中的MPs是出凝血系統(tǒng)的重要組成；同時MPs還是細胞-細胞間交流的重要調(diào)節(jié)者，是疾病和出凝血系統(tǒng)之間溝通的重要橋梁[5]。多種疾病如急性冠脈綜合征、腫瘤、糖尿病、系統(tǒng)性硬化[6-7]等已觀察到MPs水平升高與活性增加，但在多發(fā)性骨髓瘤患者中目前仍缺乏相關(guān)研究。

本研究使用流式細胞術(shù)檢測38例采用硼替佐米聯(lián)合脂質(zhì)體阿霉素、地塞米松(bortezomib+adriamycin+dexamethasone,PAD)誘導的MM患者微顆?；A(chǔ)水平及動態(tài)變化，同時全面檢測出凝血系統(tǒng)各項指標，旨在了解硼替佐米對MM患者出凝血功能和MPs水平的影響及意義。

材 料 和 方 法

1 研究對象

收錄我院2012年10月至2013年10月收治的38例初診為MM、接受PAD方案誘導化療的病人，分別在治療前和PAD方案誘導治療后第1、2、3療程采集外周血樣本。同時留取30例無高血壓病、高脂血癥、糖尿病、自身免疫性疾病等病史且半月內(nèi)未使用任何抗凝藥物的健康成年人外周血樣本作為對照組。

2 主要試劑及儀器

單克隆熒光抗體annexin V-FITC和流式細胞儀校準微球(1.0 μmol/L)均為Becton Dickinson產(chǎn)品；直徑10 μmol/L的Flow-Count熒光微球(992個/μL)為Beckman-Coulter產(chǎn)品；流式細胞儀Moflo為Beckman-Coulter產(chǎn)品。

3 方法

3.1常規(guī)凝血指標檢測 Sysmex公司CA-7000全自動血凝分析儀測定血清凝血酶原時間(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time, APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen, Fbg)、D-二聚體(D-dimer,D-D)、凝血酶時間(thrombin time,TT)、FVIII、蛋白C(protein C)、蛋白S(protein S)、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)和纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor, PAI)；Chrono-Log CA560型血小板聚集儀進行血小板聚集功能檢測。

3.2MPs的檢測方法 抽取患者清晨空腹靜脈血2.4 mL，用0.105 mol/L檸檬酸鈉抗凝，4 ℃、1 500×g、15 min離心后吸上層血漿至EP管，再4 ℃、1 900×g、15 min離心后取300 μL貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，保存在-80 ℃冰箱。上流式機前PPP在冰水混合物解凍，取40 μL PPP與5 μL annexin V- FITC、10×annexin V binding buffer 355 μL充分混合，避光孵育20 min 后加入10 μL Flow-Count熒光微球，混勻后上流式細胞儀檢測。選用鼠抗人IgG-FITC抗體作同型對照。用1.0 μm的標準微球設定前向檢測區(qū)，所有MPs均以直徑范圍在0～1.0 μm為界定范圍，并以annexin V標記總MP(total MPs，TMPs)。數(shù)5 000個熒光微球計數(shù)停止，同時記錄流式細胞術(shù)檢測到的某抗體陽性個數(shù)，按下列公式計算：某抗體陽性MPs的絕對數(shù)(/μL)= 熒光微球密度(992/μL)×某抗體陽性個數(shù)流式細胞術(shù)檢測值/血漿稀釋倍數(shù)(4)×熒光微球個數(shù)流式細胞術(shù)檢測值(5 000)，見圖1。

Figure 1. Flow cytometric analysis and quantification of MPs.A: determination of forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) characteristics of light by 1.0 μm standard beads in buffer to establish the R1 or MP gate. The R2 includes 10 μm Flow-Count beads used for enumerating MPs; B: detection of phosphatidylserine po-sitive MPs by annexin V-FITC labeling on the y-axis in relation to SSC on the x-axis.

4 統(tǒng)計學處理

符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，并采用t檢驗或方差分析；不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，并采用Mann-WhitneyU檢驗；率的比較用2檢驗；觀察指標間的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。用SPSS 17.0軟件分析。

結(jié) 果

1 研究組和對照組的臨床資料

38例多發(fā)性骨髓瘤病人，中位年齡53.5歲(范圍35～66歲)，男性22例(57.9%)，女性16例(42.1%)，患者治療前一般情況見表1。治療前9例合并出血癥狀，表現(xiàn)為鼻出血、牙齦出血，無患者出現(xiàn)血栓形成。2例患者在治療過程中發(fā)生血栓形成，均為經(jīng)外周中心靜脈置管術(shù)后3 d內(nèi)出現(xiàn)置管側(cè)的上臂靜脈血栓。截至本研究結(jié)束時38例患者中位療程數(shù)為4(2～6療程)。健康對照組30例，均為同時期志愿者，中位年齡51.5歲(范圍30～61歲)，男性17例(56.7%)，女性13例(43.3%)，與MM患者相比年齡、性別差異均無顯著(P>0.05)。

2 MM患者的出凝血異常

2.1MM患者出凝血指標和TMPs的基礎(chǔ)水平 38例新診斷MM患者血小板絕對值水平為[188.00(120.00)×109/L]，小于100×109/L有5例；血小板聚集功能明顯受抑制[ADP誘導血小板聚集試驗結(jié)果為(63.76±21.36)%]。凝血、抗凝系統(tǒng)方面，F(xiàn)VIII:C和vWF:Rco明顯高于正常值范圍，分別為(152.89±31.14)%和(165.69±38.43)%，并且兩者呈正相關(guān)(r=0.773，P<0.01)。纖溶方面，PAI水平升高[3.98(1.63)U/mL]。健康對照組TMPs水平為(134.29±63.09)/μL，而研究組中38例MM患者TMPs基礎(chǔ)水平明顯較對照組升高[(640.65±214.22)/μL，P<0.01]，見表2。

表1 多發(fā)性骨髓瘤患者的臨床特點

表2 PAD治療前后MM患者出凝血指標和TMPs水平

2.2MM患者出凝血指標與出血癥狀、骨髓瘤相關(guān)指標、療效的關(guān)系 38例MM患者治療前合并出血的有9例，其中6例為IgG型，3例為IgA型。在26例IgG型患者中M蛋白大于70 g/L的有9例，5例有出血癥狀，與小于70 g/L組相比差異顯著(P<0.05)。此外，有出血癥狀患者較無出血癥狀者TT時間延長[21.94(2.20)svs19.13(3.75)s，P<0.05]，血小板聚集功能更低[(58.41±11.28)%vs(68.70±23.74)%，P<0.05]。

MM患者血小板聚集功能與M蛋白呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.63，P<0.05)。FVIII:C、PAI與β2-MG呈正相關(guān)(r=0.763，P<0.01；r=0.618，P<0.05)，其中11例ISS分期III期患者FVIII:C[(184.73±29.57)%]要高于II期[(141.45±33.18)%，P<0.01]和I期患者水平[(135.23±31.87)%，P=0.01]。

截至本研究結(jié)束時，共35例患者完成3療程PAD治療。本研究對3療程后的療效進行評價，并將病人分為有效組(療效為部分緩解和部分緩解以上)和無效組(部分緩解以下)。8例無效組患者FVIII:C和vWF:Rco水平高于27例有效組患者[(180.81±25.22)%vs(147.95±38.51)%，P<0.01；(173.32±20.74)%vs(161.31± 33.70)%，P<0.05]。

2.3MM患者TMPs與出血癥狀、骨髓瘤相關(guān)指標、療效的關(guān)系 9例起病時伴出血癥狀的MM患者，TMPs基礎(chǔ)水平偏低[(550.63±250.26)/μLvs(710.71±181.35)/μL，P<0.05]。MM患者TMPs基礎(chǔ)水平與β2-MG正相關(guān)(r=0.672，P<0.01)。ISS分期II期和III期共28例，該群患者TMPs 明顯高于10例ISS分期I期的患者[(755.72±185.41)/μLvs(598.23±206.15)/μL，P<0.05]。3療程PAD后療效為PR或PR以上患者的TMPs基礎(chǔ)水平低于PR以下患者[(606.81±193.29)/μLvs(689.54±217.22)/μL，P<0.05]，見表3。

表3 MM患者不同指標分組TMPs的水平比較

3 MM患者PAD治療后出凝血指標和TMPs的動態(tài)變化

1療程PAD治療后，MM患者血小板聚集功能有所恢復[(69.40±22.87)%，P<0.05]，vWF:Rco下降[(149.59±43.25)%，P<0.05]，PAI水平也從3.98(1.63)U/mL下降至2.60(1.36)U/mL(P<0.01)；2療程PAD治療后血小板聚集功能平均水平恢復至正常范圍內(nèi)[(81.83±12.58)%，P<0.01]，PAI水平則進一步下降[1.92(1.40)U/mL，P<0.05]；3療程PAD治療后，PAI降至最低[0.88(1.38)U/mL,P<0.01]，血小板聚集功能和vWF:Rco則分別為(77.83±15.62)%和(151.08±41.95) %，見圖2A～C，同時D-D水平下降至198.0(208.3)μg/L，與治療前相比明顯下降(P<0.05)。FVIII:C各療程PAD治療后的平均水平與治療前相比差異無統(tǒng)計學意義，見表2。1療程PAD治療后，MM患者血小板絕對值升高，APTT、PT和TT縮短，AT-Ⅲ活性增強，但均在正常參考值范圍內(nèi)。

PAD治療后MM患者TMPs水平顯著下降，1療程PAD后TMPs下降42.57%[(378.59±163.42)/μL，P<0.01]，2療程后為33.62%，3療程后下降23.53%[(184.25±93.35)/μL]，仍高于健康對照組(P<0.05),見圖2D。3療程PAD治療后有效組的患者較無效組的患者TMPs水平更低[(174.58±103.62)/μLvs(212.38±78.84)/μL，P<0.05]，見圖2E。根據(jù)3療程PAD后M蛋白下降是否超過90%將MM患者分為2組，M蛋白下降超過90%患者TMPs下降幅度[(412.26±194.15)/μL]比小于90%的患者[(294.30±113.07)/μL]更大(P<0.01)，見圖2F。在26例IgG型患者中，3療程后IgG下降值與TMPs下降值呈正相關(guān)(r=0.496，P=0.01)，見圖3。

討 論

FVIII:C是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)酶性復合物的輔因子；vWF是一種異源性血漿多聚體糖蛋白，介導致栓表面與血小板的黏附并引起血小板聚集反應，小多聚體vWF是FVIII:C的載體蛋白。兩者水平升高是靜脈血栓形成，特別是反復靜脈血栓的高危因素之一[8]。本研究顯示治療前MM患者FVIII和vWF均升高，F(xiàn)VIII與ISS分期相關(guān)，均與文獻相符[9]。經(jīng)PAD方案治療后vWF水平降低，F(xiàn)VIII變化差異無統(tǒng)計學意義，提示PAD對FVIII和vWF活性無促進作用。

惡性漿細胞通過浸潤骨髓或分泌M蛋白等方式影響血小板的生成和功能。而硼替佐米也有抑制血小板從巨核細胞釋放和抑制血小板聚集等作用[3]。本研究證實M蛋白與血小板聚集功能呈負相關(guān)關(guān)系；PAD治療后，血小板絕對值升高，聚集功能恢復，提示PAD方案通過使疾病緩解恢復血小板的正常功能。

Figure 2. Changes of some coagulation parameters and TMPs in MM patients before and after treatments.Mean±SD.n=30 (control);n=38 (MM patients).A～D: PLT aggregation/vWF:Rco/PAI/TMPs of MM patients at different time points. The box and whisker plots are showed, in which the data in box represent the 25%～75% range with the median showed as line. The minimum and maximum levels are given as high/low bars. E: after 3 cycles of PAD, TMPs level between different response groups. F: after 3 cycles of PAD, TMPs decreased more in the patients with M protein decreasing over 90%.

Figure 3. The relationship between IgG decreased values and TMPs decreased values after 3 cycles of PAD in IgG-type MM patients.

PAI為血漿中tPA的快速抑制物，在纖維蛋白溶解的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。研究顯示NF-κB信號系統(tǒng)對PAI的表達有促進作用[10]。Yagci等[11]發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤病人纖溶活性較正常人降低，這種低纖溶狀態(tài)主要與PAI活性增強相關(guān)。本研究顯示MM患者PAI水平升高，ISS分期II、III期患者升高更明顯；經(jīng)PAD治療后，PAI水平下降，D-D水平也降低，提示PAD方案對骨髓瘤原有的纖溶異常有緩解作用。

微顆粒是從各種不同細胞膜上脫落下來的一類膜性小囊泡，當細胞受到各種物理或化學刺激，或者細胞發(fā)生凋亡時，正常的細胞膜磷脂平衡遭受破壞，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻從而以“出芽”的形式釋放出來[5]。在病理情況下，如炎癥、腫瘤、自身免疫疾病和易栓狀態(tài)等，補體復合物、腫瘤壞死因子α、IL-1β等活性因子觸發(fā)細胞被激活或發(fā)生凋亡，細胞向血漿中釋放質(zhì)膜片段，導致MPs顯著升高。MPs具有多種不同作用，不同來源的MPs作用也不盡相同，但促凝活性是所有MPs共有的。MPs的促凝活性主要表現(xiàn)在兩個方面，一是其表面攜帶激活外源性凝血途徑的組織因子，二是提供陰離子磷脂表面(如PS)供陽性凝血因子復合體的組裝和凝血瀑布的激活[6]。Bucciarelli等[12]用流式細胞術(shù)研究了186例靜脈血栓形成(venous thromboembolism,VTE)病人的MPs水平，發(fā)現(xiàn)隨著MPs水平的升高，VTE的風險也逐漸升高；MPs水平在健康對照人群水平95%以上的患者發(fā)生VTE的相對危險度是小于95%的患者的2.2倍。而微顆粒的嚴重減少可導致出血表現(xiàn)，如Scott綜合征[13]。本研究數(shù)據(jù)顯示初診MM患者TMPs比健康對照組升高，同時TMPs水平與β2-MG呈正相關(guān)，提示TMPs除反映出凝血異常外，可能還與骨髓瘤腫瘤負荷和疾病嚴重程度相關(guān)。PAD治療后TMPs明顯下降，3療程后TMPs下降水平與M蛋白下降程度相關(guān)，提示PAD使疾病緩解同時降低TMPs水平。

綜上所述，多發(fā)性骨髓瘤疾病本身存在凝血因子活化、低纖溶和微顆粒水平升高等促凝異常，PAD方案使疾病緩解同時恢復血小板功能、糾正纖溶異常，降低MPs水平。以上因素可能是MM患者采用含硼替佐米方案治療時血栓發(fā)生率低的部分原因。

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