徐根娣，邵鄰相，吳旭峰，趙甘戩

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004;2.浙江師范大學地理與環(huán)境科學學院，浙江金華 321004)

植物細胞的培養(yǎng)在生物技術(shù)專業(yè)的許多課程中都有涉及.細胞工程是生物技術(shù)專業(yè)的重要專業(yè)必修課之一，實驗課在整個課時中占有較大的比例，而植物細胞的培養(yǎng)自始至終都是這門課程的重要和關(guān)鍵的組成部分.除此之外，細胞生物學、植物體細胞遺傳學、遺傳學、基因工程下游技術(shù)、分子生物學、生化制藥技術(shù)、植物生物學和組織培養(yǎng)等課程的實驗課都涉及到植物細胞的培養(yǎng)［1］，植物細胞培養(yǎng)實驗方案的質(zhì)量直接影響著教學質(zhì)量的高低，也是提高學生動手能力的關(guān)鍵所在.因此，有必要對植物細胞培養(yǎng)的實驗技術(shù)進行研究和探索，以更好地應用于細胞工程實驗教學，為學生今后從事生物學領(lǐng)域的相關(guān)研究，進入與細胞工程有關(guān)的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)奠定必要的理論和技術(shù)基礎［2-3］.

利用植物細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)植物有用的代謝產(chǎn)物在近些年來取得了很大的發(fā)展［4-6］，但這些技術(shù)和方法往往實驗周期長并且影響因素較多，對本科實驗教學而言，由于學時的限制，植物細胞的培養(yǎng)不可能進行全新的探索.因此，開發(fā)適合本科實驗教學的綜合實驗，制訂具體化和可操作性的植物細胞培養(yǎng)方案，使生物技術(shù)專業(yè)的學生既能學到操作技術(shù)，培養(yǎng)其動手能力，又能引導他們根據(jù)所學知識進行切實可行的創(chuàng)新，提高其分析和解決問題的能力.

1 植物細胞培養(yǎng)實驗的實施過程

1.1 實驗設計和材料準備

實驗教師根據(jù)實驗室的儀器設備、藥品、耗材等情況，提供大葉黃楊(Euonymus japonicus)、七子花(Hepatcodium miconioides)、紫花地丁(Viola philippica)、大豆(Glycine max)、牽?；?Pharbitis nil)、紫茉莉(Mirabilis jalapa)、鳶尾(Iris bungei)、鴨趾草(Commelina communis)、一年蓬(Erigeron annuus)、北美車前(Plantago virginica)和加拿大一枝黃花(Solidago canadensis)等植物的嫩葉.學生根據(jù)自己的興趣自愿組合，3～4人為一小組，查閱文獻，寫出實驗方案，內(nèi)容包括:實驗意義和目的、實驗材料和方法、實驗植物種類、儀器、試劑和實驗步驟、預期結(jié)果等.經(jīng)全組同學討論后，最終確定選擇的植物材料為大葉黃楊、七子花、紫花地丁.

1.2 細胞培養(yǎng)實驗的實施

整個實驗過程在老師的指導下，由每組學生分工協(xié)作獨立完成.實驗過程如下:

1)愈傷組織的誘導和培養(yǎng)

取大葉黃楊、七子花、紫花地丁的嫩葉，用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水清洗一遍.在無菌條件下，用75%乙醇溶液浸漬30 s，再用1.5 g/L HgCl2溶液消毒5～8 min，無菌水沖洗4～5次，用濾紙將多余水分吸干，然后將頂芽和側(cè)芽切成約1 cm的小段、葉片切成約0.5 cm2的小塊，接種于附加有植物激素2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)或玉米素的瓊脂固化MS培養(yǎng)基(蔗糖20 g/L，瓊脂6 g/L，pH 5.8)上，置于(25±1)℃培養(yǎng)，以誘導愈傷組織.

2)植物細胞的懸浮培養(yǎng)

用鑷子夾取繼代4～5次生長良好的疏松型胚性愈傷組織為材料進行細胞懸浮培養(yǎng)，并將愈傷組織輕輕夾碎.在250 mL三角瓶中，加入約60 mL的MS液體培養(yǎng)基(蔗糖20 g/L，瓊脂6 g/L，pH 6.0)，分別附加有1，2 和3 mg/L 2，4-D 和0.4 mg/L 6-BA.每瓶接種1.5 ～2.0 g鮮愈傷組織，在100 r/min恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床上進行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(28±1)℃.

3)細胞記數(shù)及形態(tài)觀察

取細胞懸液，加入2倍體積的80 g/L CrO3溶液，置于70℃水浴中處理15 min.冷卻后，用移液管重復吹打細胞懸液以使細胞分散，混勻后，取一滴懸液置于血細胞記數(shù)板上記數(shù).將培養(yǎng)有細胞懸液的細胞培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡上，觀察并拍照.

2 植物細胞培養(yǎng)實驗的實施效果

實驗實施過程中，除了教師的正確指導外，還要求學生進行正確操作、仔細觀察和認真分析.例如，在外植體消毒接種時，對無菌操作的要求非常高，一不小心，就可能污染導致實驗失敗.有的學生很不耐煩，甚至想放棄，經(jīng)過教師的鼓勵，學生明白了科學實驗是不斷探索的過程，期間會出現(xiàn)難以預料的情況，需要自己去解決.另外，實驗結(jié)果要求以圖、表及照片的形式呈現(xiàn)，實驗數(shù)據(jù)須做統(tǒng)計學處理.由于各小組學生所選的實驗材料不同，結(jié)果也有差異.

2.1 愈傷組織的誘導及培養(yǎng)

1)大葉黃楊的葉片及芽接種后約12 d開始出現(xiàn)愈傷組織，且19 d后愈傷組織較為明顯，進行第1次繼代，以后每隔10 d繼代一次.大葉黃楊愈傷組織培養(yǎng)前期的生長速率較慢，繼代2次后愈傷組織生長速率迅速加快，繼代4次后形成大量的質(zhì)地疏松、乳白色的愈傷組織.其中，以2.0 mg/L 2，4-D和0.4 mg/L 6-BA共同處理的結(jié)果最為理想(見表1).

表1 不同濃度激素對植物幼葉愈傷組織誘導率的影響

2)七子花的葉片接種后第14 d開始出現(xiàn)愈傷組織，第1次轉(zhuǎn)接以后每隔10 d繼代一次.1次繼代后愈傷組織的長勢依然很弱;經(jīng)過約3～4次繼代，愈傷組織長勢逐漸好轉(zhuǎn)，愈傷組織團增大;約繼代6次后，形成較大的愈傷組織團，外觀呈致密的白色霜狀團塊.1.0 mg/L 2，4-D和0.4 mg/L 6-BA共同處理的誘導率可達74.0%(見表1).但在培養(yǎng)過程中外植體和愈傷組織均出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，并且隨培養(yǎng)時間的延長褐變程度逐漸加深.

3)紫花地丁愈傷組織的誘導周期為10 d，每12 d繼代一次.所得愈傷組織為淡黃綠色顆粒，質(zhì)地較致密，且生長狀況良好.其中，以2.0 mg/L 2，4-D和0.4 mg/L 6-BA共同處理的結(jié)果最為理想(見表1).

2.2 植物細胞的懸浮培養(yǎng)

1)取繼代4次的大葉黃楊乳白色疏松愈傷組織進行懸浮培養(yǎng).發(fā)現(xiàn):初期細胞的生長速度較慢，1周后仍未發(fā)現(xiàn)細胞明顯增殖;繼續(xù)培養(yǎng)2周后細胞增殖顯著，此時可觀察到形態(tài)清晰的單細胞(見圖1中A)、細胞團(見圖1中B)及變形細胞(見圖1中C)，細胞記數(shù)結(jié)果為2.46×103個/mL.每3 d記數(shù)1次，所得的細胞生長曲線如圖2所示.培養(yǎng)過程中出現(xiàn)輕度的褐變，且隨培養(yǎng)的進行，褐變程度有逐漸加深的趨勢.但細胞分裂繼續(xù)旺盛進行，培養(yǎng)21 d后，懸液呈現(xiàn)淺褐色.

2)將經(jīng)過3次繼代的七子花愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，此時的愈傷組織較致密，因此需在懸浮培養(yǎng)前先將愈傷組織用鑷子夾碎.2周后進行細胞觀察，七子花懸浮培養(yǎng)所得的變形長細胞頂端有月牙狀勾起，與其他植物變形細胞的差異明顯(見圖1中D).比較而言，七子花的細胞增殖速度較大葉黃楊緩慢，且變形細胞數(shù)量較多，細胞的集群性也更為明顯(見圖1中E和F).

3)紫花地丁的愈傷組織培養(yǎng)7 d后有懸浮單細胞或小細胞團出現(xiàn)(見圖1中G，H和I)，且在顯微鏡下可觀察到變形的長細胞.繼代培養(yǎng)時，加入等量的新鮮培養(yǎng)液，搖勻后稍靜置，待大細胞團塊沉降后分瓶，不需要過濾即可得到不含大細胞團塊的培養(yǎng)物［7］.此時細胞記數(shù)的結(jié)果為1.32×103個/mL.

3 植物細胞培養(yǎng)實驗的反思

3.1 植物材料選擇是實驗成敗的關(guān)鍵因素

通過對幾種校園內(nèi)常見植物的細胞培養(yǎng)的初步研究，發(fā)現(xiàn)大葉黃楊的愈傷組織長勢最為旺盛，質(zhì)地也最為疏松.紫花地丁的愈傷組織質(zhì)地較致密，且生長狀況良好，培養(yǎng)過程中只出現(xiàn)少量褐變現(xiàn)象.因此，細胞懸浮培養(yǎng)材料以大葉黃楊、紫花地丁最為理想.

圖1 大葉黃楊、七子花和紫花地丁的單細胞和細胞團

圖2 大葉黃楊、七子花和紫花地丁的細胞生長曲線

大葉黃楊為黃楊科植物，在南北方栽培都極為廣泛［8］，易栽易活，冬夏常青，取材方便，實驗不受季節(jié)限制，且組織培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的效果都較好，是不可多得的用于本科實驗教學的優(yōu)良實驗材料.懸浮培養(yǎng)時的紫花地丁出現(xiàn)輕度褐變現(xiàn)象，估計是懸液中的激素濃度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度等因素對多酚氧化酶(PPO)的生成及活性有一定的影響［9］.另外，由于植物細胞對剪切力敏感［10］，懸浮培養(yǎng)中搖床的旋轉(zhuǎn)形成的剪切力［11］易造成對細胞的傷害，主要是對植物細胞壁的破壞，從而使PPO含量升高，這也是懸液發(fā)生褐變的原因之一.懸浮培養(yǎng)過程中，學生發(fā)現(xiàn)有3瓶紫花地丁懸液發(fā)生雜菌污染，但懸液中的細胞并沒有死亡，且細胞增殖依然快速進行，因此初步判定此培養(yǎng)液中帶入的雜菌為共生菌，并不明顯影響紫花地丁懸浮細胞的生長.七子花的細胞培養(yǎng)尚未有成熟的方案.作為國家二級重點保護的瀕危植物，七子花細胞培養(yǎng)方法的探索對七子花種群的擴大及恢復有著重要的意義［12］.由于在組織培養(yǎng)中七子花的褐變現(xiàn)象嚴重，不適于本科教學的細胞培養(yǎng)實驗.

3.2 通過綜合實驗培養(yǎng)學生應用知識解決問題的能力

通過植物細胞培養(yǎng)的綜合實驗，可以提高學生的實際操作能力，例如熟練使用顯微鏡、解剖器等.同時，通過聆聽、觀察、閱讀、質(zhì)疑、記錄和分析實驗結(jié)果，逐步提高學生的觀察能力.在細胞培養(yǎng)實驗中，植物細胞代謝緩慢，因而生長速率低，需要很長時間的培養(yǎng)過程，而且長時間保持無菌狀態(tài)給培養(yǎng)帶來難度，尤其在懸浮培養(yǎng)過程中極易發(fā)生污染，因此，在實驗過程中十分強調(diào)無菌操作，這就大大提高了學生實驗過程中的耐心與細心.另外，對實驗結(jié)果的整理過程，通過表解、圖釋記錄實驗的結(jié)果，對實驗現(xiàn)象進行分析整理，找出實驗成敗的原因，并通過查閱文獻等解釋實驗現(xiàn)象，進一步提高了學生分析和解決問題的能力.

3.3 因地制宜，靈活安排實驗進度

由于植物細胞培養(yǎng)中涉及的許多實驗材料都易受區(qū)域性、季節(jié)性的影響，所以在制定學期或?qū)W年實驗計劃時必須要對全程教學內(nèi)容中所需的實驗材料、藥品等有一個全盤的計劃和安排［13］.實驗指導教師應制定出實驗的具體日程，及時采集、購買或培養(yǎng)實驗材料.在指定實驗計劃時應根據(jù)植物的不同生長期，適當調(diào)整實驗次序，制定適宜的實驗計劃.準備的實驗材料盡可能與教材的要求相一致.實驗材料應該盡量新鮮，實驗前必須保證儀器完好，藥品、材料準備充足，以保證實驗課圓滿地完成.

4 結(jié)束語

植物細胞培養(yǎng)實驗應用于細胞工程的實驗教學，實驗采取小組制，加強了學生間的團結(jié)，也鍛煉了學生進行分工合作、統(tǒng)籌安排的能力.在提供足夠的材料時，能讓每個人都有機會學習，克服了在以往的教學中因為采取小組制使某些人沒有動手機會的現(xiàn)象.由于植物細胞培養(yǎng)時間較長，可以在繼代培養(yǎng)時穿插其他實驗，盡量把材料的繼代時間安排為每周一次，這樣就在正常的實驗課時段進行實驗，不用另外抽時間進行，可以保證高質(zhì)量、高效率地完成各項實驗.總之，通過植物細胞培養(yǎng)綜合實驗的應用，可以使學生掌握較多的細胞工程實驗方法，鍛煉他們應用科學知識分析和解決問題的能力，培養(yǎng)其團隊協(xié)作和創(chuàng)新精神.

［1］彭菲，魯耀邦，雷思琦.植物細胞工程實驗教學與科研的有機結(jié)合［J］.實驗室研究與探索，2009，28(11):117-119.

［2］周杰，王海英.《細胞工程》實驗教學改革的建議與構(gòu)想［J］.實驗科學與技術(shù)，2012，10(2):131-134.

［3］梁亦龍，魏進民，張繼承.細胞工程教學改革的探索［J］.實驗室科學，2009(8):25-26.

［4］趙德修，李茂寅.培養(yǎng)基及其組成對水母雪蓮懸浮培養(yǎng)細胞生長及黃酮形成的影響［J］.生物工程學報，2000，16(1):99-102.

［5］王亞琴，葉青華，朱媛.杜仲細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸的初步研究［J］.廣西植物，2008，28(5):671-674.

［6］王健，郭政宏，劉海軍，等.魔芋細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)葡甘露聚糖的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(27):14836-14838.

［7］王俊麗，陳丕玲，楊慶仙.杜仲細胞的懸浮培養(yǎng)［J］.河北大學學報:自然科學版，1997，17(3):78-80.

［8］張照玉.新型綠化苗木——大葉黃楊［J］.中國林業(yè)，2001，16(8):25.

［9］李冬杰，張進獻，魏景芳，等.培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件與紅豆杉細胞培養(yǎng)中褐化的關(guān)系［J］.植物生理學通訊，2005，41(1):95-98.

［10］劉春朝，王玉春，鄭重，等.剪切力對植物細胞懸浮培養(yǎng)的影響［J］.化工冶金，1998，19(4):379-384.

［11］葉國洪，穆虹，徐鳳彩.培養(yǎng)條件對煙草細胞生長和CoQ10含量的影響［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2000，21(2):42-45.

［12］劉鵬，徐根娣.在生境片斷化中光對七子花生理特性的影響［J］.林業(yè)科學，2003，39(4):43-47.

［13］朱愛意.搞好師范類生物實驗教學的幾點探索［J］.浙江海洋學院學報:自然科學版，2000，19(1):98-100.