潘永娟， 金曉琴， 劉偉娜， 徐玲玲， 楊 莉

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是在某些因素的誘導(dǎo)下，由細(xì)胞內(nèi)在的有規(guī)律的機(jī)制引起的、主動(dòng)的生理性細(xì)胞自殺[1]．程序性細(xì)胞死亡(PCD)是指生物為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由多基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡過(guò)程[2]．細(xì)胞凋亡與PCD均涉及“主動(dòng)”的概念，學(xué)者們通常把這2個(gè)名詞等同使用．PCD在多細(xì)胞生物發(fā)育進(jìn)程及響應(yīng)生物或非生物脅迫刺激中均起到十分重要的作用[3]．由于與人體健康和一些重大疾病有密切關(guān)系，PCD受到眾多生物學(xué)家的重視，成為20世紀(jì)90年代生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一．

與細(xì)胞壞死不同，PCD涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等，是生物對(duì)抗環(huán)境條件變化或緩和損傷而產(chǎn)生的主動(dòng)死亡過(guò)程[4]．射線、溫度、活性氧等物理及化學(xué)因子均可誘導(dǎo)PCD發(fā)生[5]．目前已有多篇文章就PCD形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、分子機(jī)制、相關(guān)基因或蛋白，以及激發(fā)因子等展開詳細(xì)的綜述[6-10]．現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白家族、線粒體外膜VDAC(Voltage-depended anion channel),ANT(adenine nucleotide translocator),P53,Bax及DAD等蛋白均在PCD中起著重要的調(diào)控作用[11-15]．眾多研究表明，抗細(xì)胞凋亡蛋白(defender against apoptotic cell death,DAD)與動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及多種生理與病理過(guò)程密切相關(guān)．本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外的研究，綜述了動(dòng)物與植物中DAD基因的發(fā)現(xiàn)、表達(dá)特性、蛋白結(jié)構(gòu)及功能等方面的研究進(jìn)展.有關(guān)DAD1在生理及醫(yī)學(xué)方面的研究進(jìn)展參見楊舒雅等[16]的綜述．

1 DAD基因的發(fā)現(xiàn)

DAD基因最初從倉(cāng)鼠細(xì)胞系BHK21的溫度敏感突變系tsBN7中分離得到．在非致死溫度(39.5 ℃)培養(yǎng)條件下，tsBN7細(xì)胞發(fā)生凋亡，呈現(xiàn)染色質(zhì)固縮并沿核膜分布、細(xì)胞質(zhì)皺縮形成空泡、微絨毛消失及DNA片段化等現(xiàn)象．將人DADcDNA導(dǎo)入突變細(xì)胞，細(xì)胞恢復(fù)正常表型．隨后發(fā)現(xiàn)tsBN7細(xì)胞系中DADORF第38位鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，導(dǎo)致甘氨酸(Gly)突變成精氨酸(Arg)，在非致死溫度(39 ℃)培養(yǎng)條件下DAD消失，繼而發(fā)生細(xì)胞凋亡.抗細(xì)胞凋亡蛋白(DAD)也因此而得名[17]．

分支上的數(shù)值代表自展支持率/%

Nakashima等[17]同時(shí)也分離出倉(cāng)鼠和非洲爪蟾DADcDNA，發(fā)現(xiàn)人DAD氨基酸序列與倉(cāng)鼠的完全相同，與非洲爪蟾DAD相似度為91%．隨后，在秀麗新桿線蟲、大鼠、雞、蜘蛛、蝦、青石斑魚等動(dòng)物，擬南芥、水稻、蘋果、溫州蜜柑、大麥、豌豆、唐昌蒲、鳶尾、康乃馨及雪蓮等植物[18-21]，以及衣藻和酵母等中相繼分離得到同源的DAD基因．與哺乳動(dòng)物不同，Southern雜交和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)顯示擬南芥可能有2個(gè)以上DAD基因[22]，大麥存在2個(gè)DAD基因[23]，小麥中也分離出TaDAD2基因[24]，推測(cè)植物中可能存在2個(gè)以上DAD基因．因此，把與動(dòng)物相似度較高的DAD基因命名為DAD1，另一個(gè)命名為DAD2.目前研究多集中于DAD1基因的表達(dá)與功能方面．

2 DAD聚類分析、蛋白結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位

根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列，對(duì)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)已登錄的DAD1基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，如圖1所示，DAD1基因可聚類為動(dòng)物、植物和酵母3大類：衣藻與其他植物DAD1基因相似度較低；除衣藻外，植物DAD1基因再次聚類為單子葉植物和雙子葉植物兩大亞類；脊椎動(dòng)物DAD1基因聚類為一個(gè)亞類，而無(wú)脊椎動(dòng)物的DAD1基因與脊椎動(dòng)物DAD1基因、植物平行聚類．聚類分析表明DAD1基因無(wú)論是在低等真核生物酵母，還是高等真核生物動(dòng)物中都是高度保守的，但在無(wú)脊椎動(dòng)物中進(jìn)化相對(duì)較快.

對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有信息的分析表明，除單細(xì)胞生物衣藻DAD1與酵母Ost2p較為特殊，分別編碼108與130個(gè)氨基酸[25-26]外，絕大多數(shù)生物的DAD1蛋白由113～117個(gè)氨基酸組成．其中，動(dòng)物和單子葉植物的DAD1蛋白由113～114個(gè)氨基酸組成，而雙子葉植物的DAD1蛋白氨基酸長(zhǎng)度為116～117．Moharikar等[26]分析發(fā)現(xiàn)，人、小鼠、大鼠、豬、牛、非洲爪蟾、蘋果和衣藻DAD1蛋白預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為7.38～7.83，粘液菌、搖蚊、雞、擬南芥、水稻、番茄、矮牽牛、大麥和煙草DAD1蛋白預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為8.81～9.07，而豌豆DAD1蛋白預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為6.32.但是否意味著預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)就是DAD蛋白的實(shí)際等電點(diǎn)，仍有待試驗(yàn)驗(yàn)證．

Makishima等[27]發(fā)現(xiàn)DAD1是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的內(nèi)在蛋白，預(yù)測(cè)其可能有2段跨膜區(qū)域，其N端和C端均朝向胞質(zhì)一側(cè)；而Kelleher等[28]發(fā)現(xiàn)DAD1具有3段跨膜區(qū)，其N端朝向胞質(zhì)一側(cè)，而C端朝向糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough endoplasmic reticulumn,RER)腔．應(yīng)用TMHMM Server v.2.0軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)擬南芥DAD1(GenBank登錄號(hào)：Q39080.2)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，AtDAD1具有3段跨膜區(qū)(見圖2)，分別是30～52，59～81，96～115氨基酸區(qū)段，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分布朝向與文獻(xiàn)[28]的研究結(jié)果類似．AtDAD2(GenBank登錄號(hào)：NP-565807)序列分析結(jié)果與AtDAD1類似．

圖2 擬南芥DAD1跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

人DAD1基因定位于染色體14 q11～q12之間，大鼠DAD1基因定位于14號(hào)染色體[29]，而雞T-細(xì)胞中DAD1基因位于受體α鏈恒定基因(T-cell receptor alpha chain constant region,TCRAC)下游6.3 Kb處，包含2個(gè)翻譯的外顯子及1個(gè)不被翻譯的外顯子，其中第2個(gè)內(nèi)含子中包含1段反向的恒定區(qū)(constant region，CR)重復(fù)序列[30]．人神經(jīng)細(xì)胞瘤DAD1 mRNA逆轉(zhuǎn)錄后插入基因組的假基因DADR定位于染色體12p11.2～12p12.1之間，該區(qū)域也是多個(gè)可能致癌基因的分布區(qū)域[31]．韓永華等[32]檢測(cè)到薏苡DAD1基因定位于第9號(hào)染色體短臂，與著絲粒的百分距離為67.44±1.45．此外，我們根據(jù)擬南芥DAD1基因序列(GenBank登錄號(hào)：NC003070)分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥DAD1基因中具有4個(gè)外顯子，內(nèi)含子區(qū)域中無(wú)其他基因．

3 DAD基因的表達(dá)特性

動(dòng)物DAD1幾乎在所有組織中表達(dá)，但在不同動(dòng)物、不同組織中表達(dá)強(qiáng)度存在差異，并且DAD1下調(diào)表達(dá)發(fā)生在PCD之前．青石斑魚EaDAD1轉(zhuǎn)錄水平在脾臟和肝臟組織中高于其他組織，而注射了脂多糖的各組織中DAD1表達(dá)水平高于未處理的組織[18]．牦牛BgDAD1 mRNA在脾臟、心臟、肝臟和腎臟中均可檢測(cè)到，而在肌肉和乳腺中沒有發(fā)現(xiàn)[33]．海灣扇貝大部分組織均表達(dá)DAD1基因，但受傷處表達(dá)水平顯著增高[34]．此外，DAD1表達(dá)水平與溫度關(guān)系密切.如在大腹圓蛛不同組織中均可檢測(cè)到DAD1，但其表達(dá)水平受溫度影響，低溫(4 ℃)與高溫(37 ℃)條件下mRNA水平明顯高于25 ℃時(shí)的表達(dá)水平[35]．Moharikar等[26]發(fā)現(xiàn)在紫外光照射下衣藻細(xì)胞DAD1基因表達(dá)在PCD啟動(dòng)時(shí)急劇下降．

與動(dòng)物相似，植物中DAD基因時(shí)空表達(dá)范圍十分廣泛，在所有組織及發(fā)育各階段均有表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度存在顯著差異，且大多數(shù)植物DAD1隨著組織的衰老表達(dá)下調(diào)．如AtDAD1在擬南芥所有組織中均可檢測(cè)到，但在成熟及角果干化階段轉(zhuǎn)錄水平下降[22]．玉米ZmDAD1在衰老組織及新陳代謝活躍的組織中表達(dá)量較高[36]．GhDAD1在棉花各組織中均有表達(dá)，但在花和種胚等幼嫩組織中表達(dá)水平較高，在纖維等衰老組織中表達(dá)水平較低[37]．小麥TaDAD2在所有組織中均表達(dá)，在葉中表達(dá)水平最高，花與穗中的表達(dá)水平相對(duì)較低[24]．豌豆、鳶尾花和康乃馨衰老花瓣中DAD1基因的表達(dá)也呈下調(diào)模式[38-39]．桂花OfDAD1處于鈴梗期表達(dá)量最高，隨著花瓣逐漸開放，DAD1表達(dá)急劇下降，后期雖緩慢回升，但仍維持在較低的水平[40]．?dāng)M南芥與柑橘DAD1轉(zhuǎn)錄水平也隨著花和葉片的衰老逐步降低[41].但是，蘋果MpDAD1隨著花和葉片的衰老表達(dá)水平逐步增加[42]．從DAD基因的表達(dá)結(jié)果中推測(cè),DAD基因家族不同成員的表達(dá)模式可能不同，其生物學(xué)功能也存在差異．

由此可見，無(wú)論動(dòng)物還是植物中，DAD基因的時(shí)空表達(dá)范圍都較為廣泛，在大部分組織及生長(zhǎng)發(fā)育各階段均有表達(dá)，但其表達(dá)強(qiáng)度和模式存在明顯的差異，其表達(dá)也受到激素、溫度等因素的影響，這也間接證明了該基因在生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有十分重要的生物學(xué)功能．

4 DAD蛋白的生物學(xué)功能

倉(cāng)鼠溫度敏感型tsBN7細(xì)胞株中DAD1基因第38位鳥嘌呤G突變?yōu)橄汆堰蔄，導(dǎo)致DAD1蛋白在非致死溫度下消失，引發(fā)tsBN7細(xì)胞凋亡，DAD1也因此被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控因子[17]．人、擬南芥和水稻DAD1 cDNA能夠阻止tsBN7在非致死溫度下的細(xì)胞凋亡，表明動(dòng)物與植物DAD1具有相似的生物學(xué)功能[17,22]．

Nishii等[43]應(yīng)用基因敲除技術(shù)沉默小鼠DAD1基因，發(fā)現(xiàn):DAD1雜合突變小鼠呈現(xiàn)胸腺發(fā)育不完全及足的并趾現(xiàn)象，但仍可繁殖后代;而DAD1純合突變小鼠胚細(xì)胞則表現(xiàn)為嚴(yán)重的發(fā)育障礙或死亡，不能培育成完整個(gè)體．體外胚泡培養(yǎng)中DAD1雜合缺失突變雌性小鼠的細(xì)胞呈現(xiàn)畸形[44].缺失DAD1基因的小鼠晶胚細(xì)胞N-糖基化蛋白質(zhì)表達(dá)異常，胚胎發(fā)育遲緩，中胚層與外胚層凋亡水平增加[45]．上述研究結(jié)果表明DAD1具有拮抗PCD的能力．DAD1的轉(zhuǎn)錄水平在T細(xì)胞生成過(guò)程中是變化的，呈先下降后上升的趨勢(shì)，并在成熟胸腺細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高，表明DAD1可增強(qiáng)免疫系統(tǒng)T細(xì)胞的增殖，是成熟T細(xì)胞發(fā)揮功能所必需的，但并不能使胸腺T細(xì)胞免于凋亡[46]．

Bcl-2能夠阻止細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制PCD發(fā)生．Bcl-2家族中成員Mcl-1 C端BH2結(jié)構(gòu)域?qū)AD1的活性發(fā)揮是必要的．Mcl-1可抑制DAD1缺失導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，推測(cè)DAD1蛋白作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞死亡的抑制因子，可能在Bcl-2蛋白的下游發(fā)揮作用[27]．Makishima等[27]以DAD1為誘餌，發(fā)現(xiàn)人B細(xì)胞庫(kù)中Mcl-1可與DAD1發(fā)生蛋白互作，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)DAD1蛋白C端59～113氨基酸序列能夠與Mcl-1蛋白BH2結(jié)構(gòu)域互作．

DAD1與酵母Ost2p序列有40%的相似性，而Ost2p是酵母OST復(fù)合物的組成亞基之一，推測(cè)DAD1也可能是OST復(fù)合物的亞基組分[27]．OST復(fù)合物的功能是在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)催化高甘露寡聚糖轉(zhuǎn)移到新生多肽的天冬酰胺殘基上，對(duì)新合成蛋白質(zhì)進(jìn)行N-糖基化修飾[47]．Kelleher等[28]將DAD1與其他3個(gè)OST組分(核糖體結(jié)合蛋白R(shí)Ⅰ，核糖體結(jié)合蛋白R(shí)Ⅱ及膜蛋白OST48)同時(shí)純化，證實(shí)4組分間能相互交聯(lián)，為DAD1是OST復(fù)合物組成亞基提供了生化證據(jù).DAD1蛋白N端前28個(gè)氨基酸能夠與Ost48蛋白C端互作[48]．將擬南芥DAD1序列提交至互作蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)軟件STRING(http://string.embl.de/)分析，發(fā)現(xiàn)AtDAD1與GCS(Glucosidase 1)，AT1G24320，STT3B(Staurosporin and temperature senstive 3-like b)等N-糖基化相關(guān)蛋白可能互作(見圖3)，其結(jié)果仍有待于進(jìn)一步驗(yàn)證．

DAD1基因缺失可引起OST48快速降解，在一定程度上導(dǎo)致核糖體蛋白解聚，并伴隨N-糖基化活性喪失．PCD發(fā)生于DAD1蛋白消失24 h后，說(shuō)明DAD1缺失不立即啟動(dòng)PCD，但影響OST48和核糖體蛋白的穩(wěn)定性，造成OST復(fù)合物功能失活[49]，推測(cè)其可能的機(jī)制是DAD1蛋白缺失引起OST復(fù)合物快速降解，新生肽不能進(jìn)行糖基化修飾，而未能糖基化或錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)力反應(yīng)(stress response)，促使PCD相關(guān)基因活化.Roboti等[50]也證實(shí)DAD1能夠調(diào)控OST的穩(wěn)定性，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的N-糖基化．

DGL1,STT3A,STT3B:OST復(fù)合物亞基;GCS1:葡萄糖苷酶AT1G24320:α-葡萄糖苷酶;AT1G52600:信號(hào)肽ATG1:擬南芥跨膜蛋白;AT1G77350與AT4G29735:未知蛋白

在植物中，AtDAD1基因具有一定的抵御細(xì)胞凋亡的能力[51].超表達(dá)AtDAD1基因擬南芥植株較野生型更為強(qiáng)壯，可耐受高濃度H2O2處理，葉片糖含量顯著提高，推測(cè)AtDAD基因可能參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，并在抵御PCD過(guò)程中發(fā)揮作用[52]．?dāng)M南芥突變體npr1-3與npr1-3過(guò)量表達(dá)病程相關(guān)基因非表達(dá)子(nonexpresser of pathogenesis related gene,NPR1)轉(zhuǎn)基因株系基因差異表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，AtDAD1基因表達(dá)差異顯著，表明DAD1是植物系統(tǒng)獲得性抗性所必需的[53]．孫建富等[21]從雪蓮cDNA文庫(kù)中分離SiDAD1基因，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草提高了對(duì)干旱、高鹽的耐受性，減緩了其在逆境條件下的衰老．在本氏煙葉片中過(guò)量表達(dá)小麥TaDAD2基因可抑制細(xì)胞凋亡，沉默TaDAD2基因能促進(jìn)小麥拮抗小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)浸染，并且發(fā)現(xiàn)TaDAD2在小麥條銹病侵染初期抑制PCD，但在侵染后期階段不起作用或促進(jìn)PCD的發(fā)生[24]．平邑甜茶中的MhDAD基因表達(dá)水平隨著逆境脅迫程度的加劇而不斷下降，植物抵御脅迫能力下降[54]． 徐玲玲等[55]分離了本氏煙(Nicotianabenthamiana)NbDAD1基因，發(fā)現(xiàn)NbDAD1超表達(dá)抗性植株在長(zhǎng)勢(shì)、形態(tài)等方面與對(duì)照無(wú)明顯差異，而攜帶HAtag標(biāo)簽NbDAD1基因超表達(dá)株表現(xiàn)出腋芽分蘗數(shù)減少，推測(cè)DAD1在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也起到十分重要的作用．

5 結(jié)論與展望

如上所述，DAD基因是高度保守的內(nèi)源性抑制細(xì)胞凋亡基因，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，是OST復(fù)合物的亞基組分之一，幾乎在各種組織和各個(gè)發(fā)育階段都會(huì)被檢測(cè)到．在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，DAD蛋白對(duì)新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾；DAD缺失或突變后，導(dǎo)致OST復(fù)合物功能失活，大量非正常蛋白積累于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，誘發(fā)PCD；超表達(dá)DAD基因能夠抑制與延緩植物PCD，促進(jìn)拮抗生物或非生物脅迫．

現(xiàn)有研究結(jié)果使人們對(duì)DAD蛋白的生物學(xué)功能有了一定的了解，但仍有許多疑問(wèn)懸而未決．例如：在擬南芥、大麥與小麥中推測(cè)可能或發(fā)現(xiàn)有2個(gè)DAD基因，在其他植物中是否也有多個(gè)DAD基因？這些基因間屬于功能互補(bǔ)還是同時(shí)發(fā)揮作用？DAD等OST復(fù)合物到底對(duì)哪些特定蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾，這些蛋白質(zhì)在生物發(fā)育進(jìn)程中起何作用？DAD蛋白除了參與糖基化修飾、延緩PCD發(fā)生外，是否還具有其他重要的生物學(xué)功能？上述問(wèn)題的解決，將對(duì)DAD基因應(yīng)用于腫瘤發(fā)病機(jī)制研究、新藥開發(fā)、農(nóng)作物抗逆性狀的遺傳改良、優(yōu)良種質(zhì)資源的開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)．

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