崔龍波,遲 爽,李新華,韓 濤,李 倩,趙振軍,馬家好

(1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005;2.海豐水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)部,福建 寧德 352100;3.利洋水產(chǎn)科技有限公司,廣東 廣州 518518)

大黃魚(Pseudosciaenecrocea)主要分布于中國黃海南部、東海、南海等海域,是我國重要海水經(jīng)濟(jì)魚類之一．我國大黃魚繁育及養(yǎng)殖技術(shù)處于世界領(lǐng)先地位,苗種數(shù)量、養(yǎng)殖規(guī)模和成魚產(chǎn)量都居世界之首,2008年全國養(yǎng)殖大黃魚產(chǎn)量達(dá)65 977 t[1]．魚類對食物的消化和吸收是直接關(guān)系其生長、發(fā)育和繁殖的重要生命活動,因此隨著大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,對其消化系統(tǒng)的研究更具迫切性．林樹根等[2]研究了大黃魚消化道器官的顯微與亞顯微結(jié)構(gòu),朱愛意和褚學(xué)林[3]檢測了大黃魚消化道不同部位兩種消化酶的活力分布,徐曉津等[4]對大黃魚消化系統(tǒng)的胚后發(fā)育進(jìn)行了組織學(xué)研究．為了確定合理的飼養(yǎng)技術(shù)措施,國內(nèi)外學(xué)者對魚類消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及消化酶的分布與特性進(jìn)行了比較深入和系統(tǒng)的研究,并隨著技術(shù)的發(fā)展逐步由形態(tài)學(xué)研究深入到組織化學(xué)和細(xì)胞學(xué)等研究領(lǐng)域[5-7]．本研究中,作者以組織學(xué)及組織化學(xué)技術(shù)為研究手段,對大黃魚的消化系統(tǒng)進(jìn)行研究,旨在了解大黃魚攝食、消化和吸收的生理機(jī)制,并為大黃魚配合餌料研制及優(yōu)化養(yǎng)殖提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

健康正常的大黃魚于2011年1月取自福建寧德大黃魚養(yǎng)殖區(qū),試驗個體14月齡,共8尾魚,雌雄各半．解剖取出消化系統(tǒng)各器官后進(jìn)行以下研究．

1.2 方法

1.2.1 組織學(xué)研究 采集的各器官組織塊于Bouin氏液固定,石蠟包埋切片,切片厚5～6 μm,蘇木精-伊紅(H.E)染色．

1.2.2 組織化學(xué)研究 根據(jù)染色方法的不同,各組織塊分別置于Bouin氏液或Gendre氏液固定,石蠟包埋切片,切片厚5～7μm,分別進(jìn)行如下染色:PAS反應(yīng)顯示多糖,唾液消化后PAS反應(yīng)顯示糖原,Alcian藍(lán)-PAS反應(yīng)顯示中性與酸性粘多糖．另取各器官新鮮組織塊直接于恒冷冰凍切片機(jī)上切片,切片厚6～10 μm,分別進(jìn)行如下染色:Cunnigham氏明膠薄膜法顯示蛋白酶,Gomori氏吐溫(40和80)法顯示脂酶,酸性乙酸-α-萘酯-六偶氮對品紅法顯示非特異性酯酶,Gomori氏鈣鈷法顯示堿性磷酸酶,以及Gomori氏硝酸鉛法顯示酸性磷酸酶．

以上組織化學(xué)研究方法見文獻(xiàn)[8]．

2 結(jié) 果

大黃魚消化系統(tǒng)由消化道和消化腺組成,消化道包括口、胃、幽門盲囊、腸和肛門,消化腺包括肝臟和胰腺．

2.1 組織學(xué)研究

2.1.1 胃 胃是大黃魚消化道最發(fā)達(dá)、管壁最厚的部分,可以分為胃前、胃中和胃后3段,但3段之間無明顯界限．胃壁橫切面從內(nèi)向外由粘膜、粘膜下層、肌層及外膜構(gòu)成,粘膜又可分為上皮、固有層和粘膜肌層．在胃前段,粘膜上皮除單層柱狀細(xì)胞外,還有許多體積較大的粘液細(xì)胞(圖1a);固有層與粘膜下層連續(xù)在一起,為疏松結(jié)締組織,無粘膜肌層;肌層為骨骼肌;外膜為疏松結(jié)締組織．在胃中和胃后段,胃粘膜形成大的縱行皺襞,粘膜表面有許多胃小凹,由上皮內(nèi)陷而成．粘膜上皮主要為單層柱狀細(xì)胞,細(xì)胞核橢圓形,位于細(xì)胞基底部．固有層較厚,含有發(fā)達(dá)的胃腺,胃腺為單管狀腺,腺管平行排列,開口于胃小凹處．胃腺上皮由2種細(xì)胞構(gòu)成,Ⅰ型細(xì)胞較少,僅位于胃腺的頸部,與粘膜上皮相連,細(xì)胞呈矮柱狀,胞質(zhì)染色較淺;Ⅱ型細(xì)胞為胃腺上皮的主體,細(xì)胞呈立方狀,胞質(zhì)染色較深(圖1b)．有環(huán)形平滑肌組成的粘膜肌層,粘膜下層為很厚的疏松結(jié)締組織,肌層由內(nèi)環(huán)肌、外縱肌2層平滑肌組成,縱肌層較厚．

2.1.2 幽門盲囊與腸 大黃魚在胃中部與腸相連的部位發(fā)出十余個細(xì)小的盲管,類似香蕉狀,此為幽門盲囊．腸從胃中部向后發(fā)出,在腹腔內(nèi)縱向形成2個回折止于肛門．幽門盲囊與腸的組織學(xué)結(jié)構(gòu)基本一致,管壁均由粘膜、粘膜下層、肌層和外膜層構(gòu)成．幽門盲囊和腸管內(nèi)壁形成發(fā)達(dá)的皺襞和絨毛(圖1c),幽門盲囊的絨毛長而相互交聯(lián)成網(wǎng)狀,但腸后段皺襞和絨毛數(shù)目逐漸減少．粘膜上皮主要為紋狀緣發(fā)達(dá)的單層柱狀細(xì)胞,其間分布較多的粘液細(xì)胞．在幽門盲囊和腸壁內(nèi)未見腸腺．

2.1.3 肝臟 肝細(xì)胞排列成不規(guī)則的索狀,肝細(xì)胞索之間的空隙為肝血竇(圖1d)．肝細(xì)胞體積較大,細(xì)胞核大而圓,有1個或2個核仁,細(xì)胞質(zhì)豐富．中央靜脈和小葉間組織不明顯,有散在的膽管．

2.1.4 胰腺 大黃魚胰腺為彌散性腺體,除少量散在于肝組織外,主要分布在胃、腸周圍．胰腺為復(fù)管泡狀腺,胰腺細(xì)胞呈柱狀或錐形,胞質(zhì)基底端嗜堿性,游離端含有嗜酸性酶原顆粒,或排空呈空泡狀,核仁明顯(圖1e)．胰腺組織內(nèi)有大小不等的黑色素巨噬細(xì)胞中心．

2.2 組織化學(xué)研究

2.2.1 PAS反應(yīng) 胃前段、幽門盲囊與腸粘膜粘液細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),胃腺Ⅰ型細(xì)胸的細(xì)胞質(zhì),以及肝細(xì)胞質(zhì)中的顆粒呈紫紅色,表明含多糖類物質(zhì)(圖1f)．

2.2.2 唾液消化后PAS反應(yīng) 肝細(xì)胞質(zhì)中顆粒的紫紅色消失,表明肝細(xì)胞含有糖原．

2.2.3 Alcian藍(lán)-PAS反應(yīng) 胃前段粘膜粘液細(xì)胞及胃腺Ⅰ型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈紫紅色，表明含中性和酸性混合粘液物質(zhì)(圖1g).幽門盲囊與腸粘膜粘液細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色，表明含酸性粘液物質(zhì)(圖1h).

2.2.4 明膠薄膜法 胃中后端胃腺Ⅱ型細(xì)胞的游離端、幽門盲囊及腸粘膜柱狀細(xì)胞的游離端呈透明空斑，表明具蛋白酶活性，其中胃腺Ⅱ型細(xì)胞和腸后段粘膜柱狀細(xì)胞的蛋白酶活性最強(qiáng)(圖1i,j).肝細(xì)胞的游離端及胰腺細(xì)胞游離端的酶原顆粒呈現(xiàn)弱陽性(圖1k).

2.2.5 吐溫法 胃中后段、幽門盲囊及腸粘膜柱狀細(xì)胞的游離端有棕色顆粒,表明具脂酶活性(圖1l)．

2.2.6 酸性乙酸-α-萘酯-六偶氮對品紅法 胃、幽門盲囊和腸粘膜柱狀細(xì)胞的游離端細(xì)胞質(zhì)、肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)及胰腺細(xì)胞游離端的酶原顆粒呈紅棕色,表明具非特異性酯酶活性(圖1m,n)．幽門盲囊和腸粘膜柱狀細(xì)胞的非特異酯酶活性強(qiáng)于其它部位的細(xì)胞．

2.2.7 鈣鈷法 幽門盲囊和腸粘膜柱狀細(xì)胞的游離端質(zhì)膜呈黑色,表明具堿性磷酸酶活性(圖1o)．

2.2.8 硝酸鉛法 幽門盲囊和腸粘膜柱狀細(xì)胞游離端有棕褐色顆粒,表明具酸性磷酸酶活性(圖1p),其中腸后段粘膜柱狀細(xì)胞的酸性磷酸酶活性最強(qiáng)．

3 討 論

魚類的食性與其消化系統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)和消化機(jī)能密切相關(guān)．本研究表明,大黃魚消化系統(tǒng)各器官的組織結(jié)構(gòu)不同,消化酶的種類和活性也呈明顯的差異,由此承擔(dān)不同的消化與吸收機(jī)能．

(a)胃前段(H.E) ; (b)胃后段(H.E); (c)腸(H.E); (d)肝臟(H.E); (e)胰腺(H.E); (f)腸(PAS反應(yīng)); (g)胃后段(Alcian藍(lán)-PAS反應(yīng)); (h)腸(Alcian藍(lán)-PAS反應(yīng)); (i)胃后段(明膠薄膜法); (j)腸后段(明膠薄膜法); (k)肝臟(明膠薄膜法); (l)腸(吐溫40法); (m)胃后段(酸性乙酸-α-萘酯-六偶氮對品紅法) ;(n)幽門盲囊(酸性乙酸-α-萘酯-六偶氮對品紅法); (o)腸(鈣鈷法); (p)腸(硝酸鉛法)C. 柱狀細(xì)胞; H. 肝細(xì)胞; L. 胃(腸或幽門盲囊)腔; M.粘液細(xì)胞; P. 胰腺細(xì)胞; S. 粘膜下層; Ⅰ. 胃腺Ⅰ型細(xì)胞; Ⅱ. 胃腺Ⅱ型細(xì)胞; 標(biāo)尺=70 μm

胃是大黃魚消化道最膨大的部分，能容納較多的食物，也是進(jìn)行消化作用的重要場所.大黃魚胃中后段具有發(fā)達(dá)的胃腺，胃腺上皮由Ⅰ型細(xì)胞和Ⅱ型細(xì)胞兩種細(xì)胞構(gòu)成，組織化學(xué)研究顯示Ⅱ型細(xì)胞呈現(xiàn)很強(qiáng)的蛋白酶活性，與大菱鲆Scophthalmusmaximus胃腺細(xì)胞的組成與功能相似[5].電鏡觀察顯示大黃魚胃腺細(xì)胞是一種典型的泌酸胃酶細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)含有相當(dāng)多的微管泡系和酶原顆粒[2].不同的消化酶在魚類各消化器官內(nèi)的分布存在差異，消化酶活力是反映魚類消化生理機(jī)能的一項重要指標(biāo)，其高低決定魚類對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力，而大黃魚蛋白酶活力在各消化器官中以胃最強(qiáng)[3].大黃魚胃腺Ⅰ型細(xì)胞即林樹根等[2]觀察到的粘液腺，組織化學(xué)研究顯示它與胃前段粘膜粘液細(xì)胞一樣分泌中性和酸性混合粘液物質(zhì)，這些粘液物質(zhì)可保護(hù)胃粘膜免受鹽酸和胃酶的消化作用[9].

幽門盲囊是肉食性魚類特有的消化器官[10],有些魚類的幽門盲囊中不僅存在較強(qiáng)的消化酶活性,而且還具有強(qiáng)大的消化功能[11]．本研究顯示大黃魚幽門盲囊的組織結(jié)構(gòu)和酶的種類與腸基本相同,表明二者的功能是一致的．腸道對食物的消化、吸收主要與粘膜表面結(jié)構(gòu)和腸道的分泌能力有關(guān)[12]．大黃魚幽門盲囊與腸粘膜形成許多縱行皺襞,皺襞上又有許多分支腸絨毛,粘膜柱狀細(xì)胞又有發(fā)達(dá)的紋狀緣,這些都有效擴(kuò)大了粘膜與食物接觸的消化與吸收面積．在本研究所檢測的消化酶中,幽門盲囊與腸所含酶的種類最多,表明幽門盲囊與腸在大黃魚消化與吸收方面的作用非常重要．

大黃魚幽門盲囊與腸粘膜柱狀細(xì)胞蛋白酶的活性僅次于胃腺．一般認(rèn)為魚類對食物的消化主要發(fā)生在胃、幽門盲囊和腸的前部,大多數(shù)魚類腸道中的消化酶活性由前段向后段呈現(xiàn)遞減趨勢．Tengjaroenkul等[7]研究了羅非魚0reochromisniloticus消化酶的分布模型,表明腸道末端基本上沒有酶活性(包括淀粉酶、肽酶、脂酶和蛋白酶等)．然而,本研究卻顯示大黃魚腸后段蛋白酶的活性強(qiáng)于腸前段和中段,體外對蛋白酶活力的研究也證實這一點[3],表明大黃魚腸后段仍然具有很強(qiáng)的消化能力．在對4種鲇形目魚消化酶的研究中,發(fā)現(xiàn)腸道是各消化區(qū)段中消化脂肪的主要部位[13],并且脂肪酶活性與魚攝食的食物脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系[10]．本研究表明,大黃魚僅幽門盲囊與腸粘膜柱狀細(xì)胞具有脂肪酶活性．

已在幾種魚發(fā)現(xiàn)非特異酯酶參與類脂的消化[14]和類脂的吸收[15]．因在腸上皮細(xì)胞中觀察到含有類脂的囊泡,一般認(rèn)為腸與類脂吸收密切相關(guān)[16]．由于魚以類脂而非碳水化合物和蛋白質(zhì)作為其主要營養(yǎng)來源,所以非特異酯酶的存在對魚類可能更重要[14]．與歐洲無須鱈Merlucciusmerluccius一樣[6],大黃魚對羧基酯的水解主要發(fā)生在幽門盲囊和腸,因為幽門盲囊和腸粘膜柱狀細(xì)胞的非特異酯酶活性強(qiáng)于其它部位的細(xì)胞．

堿性磷酸酶主要見于發(fā)生活躍轉(zhuǎn)運的細(xì)胞膜,它參與吸收過程,因此被認(rèn)為是營養(yǎng)吸收的標(biāo)志物[17]．消化酶作用產(chǎn)生的小的多肽和氨基酸可以借助堿性磷酸酶和ATP酶的共同作用穿過細(xì)胞膜[15,18]．因此,存在堿性磷酸酶活性的大黃魚幽門盲囊和腸發(fā)揮著重要的吸收作用．已有研究表明大菱鲆Scophthalmusmaximus腸上皮細(xì)胞能夠通過胞飲作用和細(xì)胞內(nèi)消化來加工攝入的外源性食物[19],林樹根等[2]在大黃魚腸上皮細(xì)胞胞質(zhì)上方觀察到散在分布的溶酶體,本研究中顯示大黃魚幽門盲囊與腸柱狀細(xì)胞呈現(xiàn)酸性磷酸酶活性,而酸性磷酸酶是溶酶體的標(biāo)志酶,因此大黃魚幽門盲囊與腸柱狀細(xì)胞可通過胞吞作用,在溶酶體的參與下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)消化,從而實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收．

肝臟是魚類最大的消化腺體,具有分泌、解毒、儲存等作用[10]．大黃魚胰腺為彌散性腺體．在本研究所檢測的消化酶中,大黃魚肝細(xì)胞和胰腺細(xì)胞表現(xiàn)出弱的蛋白酶活性及非特異性酯酶活性．此外,肝胰臟還是淀粉酶生成的主要器官,它分泌機(jī)能的強(qiáng)弱直接影響魚類對食物中淀粉的消化能力[3,20]

參考文獻(xiàn):

[1] 廖紅梅,林培華,高健.寧德市大黃魚成魚養(yǎng)殖現(xiàn)狀及對策[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(1):165-168.

[2] 林樹根,陳文烈,鐘秀容,等.大黃魚消化道器官顯微與亞顯微結(jié)構(gòu)[J].水產(chǎn)學(xué)報,2002,26(5):396-401.

[3] 朱愛意,褚學(xué)林.大黃魚(Pseudosciaenacrocea)消化道不同部位兩種消化酶的活力分布及其受溫度、pH的影響[J].海洋與湖沼,2006,37(6):561-567.

[4] 徐曉津,王軍,謝仰杰,等.大黃魚消化系統(tǒng)胚后發(fā)育的組織學(xué)研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報,2010,25(2):107-112.

[5] 崔龍波,周雪瑩,呂虹,等.大菱鲆消化系統(tǒng)的組織學(xué)和組織化學(xué)研究[J].海洋水產(chǎn)研究,2008,29(6):47-51.

[6] Kozaric Z,Kuzir S,Nejedli S,et al.Histochemical distribution of digestive enzymes in hake,MerlucciusmerlucciusL[J].Vet Arhiv,2004,74(4): 299-308.

[7] Tengjarnenkul B,Smith B J and Caceci T.Distribution of intestinal enzyme activities along the intestinal tract of cultured Nile tilapia (Oreochromisniloticus)[J].J Aquaculture,2000,182:317-327.

[8] Pearse A G E.Histochemistry,Theoretical and Applied[M].4th edition.London:Churchill Livingastone,1983.

[9] Allen A.Gastrointestinal Mucus[M]//Schultz S G,Forte J G,Raumer B B. Handbook of Physiology,Section 6:The gastrointestinal lumen. Bethesda:American Physiological Society,1989: 359-382.

[10] 尾崎久雄.魚類消化生理(上冊)[M]. 吳尚忠，譯.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1985.

[11] Bezerra R S,Santos J F D,Lino M A S.Characterization of stomach and pyloric caeca proteinases of tambaqui (Colossomamacropomum)[J].J Food Biochem,2000,24(3): 189-199.

[12] 葉元土,林仕梅,馮興無,等.長吻鮠和南方大口鯰胃腸道消化能力的研究[J].動物學(xué)研究,1997,18(3):305-313.

[13] 沈怡.四種鲇形目魚消化系統(tǒng)及消化酶的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2007.

[14] Chakrabarti I,Gani M A,Chaki K K,et al.Digestive enzymes in 11 freshwater teleost fish species in relation to food habit and niche segregation[J].Comp Biochem Physiol A,1995,112: 167-177.

[15] Gawlicka A,Teh S J,Hung S S O,et al.Histological and histochemical changes in the digestive tract of white sturgeon larvae during ontogeny[J].Fish Physiol Biochem,1995,14: 357-371.

[16] Diaz J P,Guyot E,Vigier S,et al.First events in lipid absorption during post-embryonic development of anterior intestine in gilt-head sea bream[J].J Fish Biol,1997,51: 180-192.

[17] Senger H,Sch R R,Schmidt H,et al.Digestive enzymes in larvalCoregonuslaveratusL[J].J Fish Biol,1989,35:249-263.

[18] Baglole C J,Goff G P， Wright G M.Distribution and ontogeny of digestive enzymes in larval yellowtail and winter flounder[J].J Fish Biol,1998,53: 767-784.

[19] 陳慕雁,張秀梅,連建華.大菱鲆仔稚魚期消化酶及堿性磷酸酶活性的變化[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2005,35(3):483-486.

[20] 葉元土,林仕梅,羅莉,等.溫度、pH值對南方大口鲇、長吻鮠蛋白酶和淀粉酶活力的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報,1998,13(2):17-23.