劉宇仁 湖南省醴陵市婦幼保健院產(chǎn)前檢查室 412200

新生兒中染色體出現(xiàn)異常的發(fā)生率近似為0.83%，其中大約一半新生兒因遺傳物質(zhì)總量變化而引起生長發(fā)育緩慢、智力下降、性發(fā)育異常以及畸形等臨床表現(xiàn)［1］。近些年來國內(nèi)通常采用血清學(xué)三聯(lián)檢查為診斷染色體異常的手段，與孕婦年齡及胎齡等標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合篩選高危個例并給予產(chǎn)前診斷［2］。Klinger等學(xué)者［3］在1992年初次使用FISH技術(shù)直接檢驗未培養(yǎng)過的羊水細(xì)胞，產(chǎn)前診斷的時間顯著縮短。目前由于FISH操作技術(shù)的簡便性及穩(wěn)定的性質(zhì)逐漸引起廣泛重視。本組研究采用FISH探針試劑盒快速檢驗1500例羊水標(biāo)本的X、Y、21、18、13等5條染色體的數(shù)目?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為對本院2009年1月－2012年1月接受產(chǎn)前診斷的1500例孕婦，年齡20～46歲，平均年齡（30±1.8）歲，胎齡18～30周，平均胎齡（25±1.4）周。所有孕婦均在知情同意書上簽字。進(jìn)行檢測的孕婦產(chǎn)前全部經(jīng)唐氏篩查后概況：1500例產(chǎn)婦中，625例為21－三體綜合征患者，占41.67%；272例為21－三體綜合征并高齡產(chǎn)婦，占18.33%；16例為18－三體綜合征并高危產(chǎn)婦，占1.07%；4例為18－三體綜合征高危且高齡病患，占0.27%；5例21－三體綜合征并18－三體綜合征且均為高危者，占0.33%，其他（胎兒多出現(xiàn)畸形、近親婚姻、分娩過21－三體綜合征胎兒、夫妻兩方染色體均異常、分娩過18－三體綜合征胎兒）46例，占3.07%。

1.2 方法

1.2.1 穿刺羊膜：經(jīng)彩色B超定位和指引，皮膚予消毒，于腹壁迅速進(jìn)針，抽吸10ml羊水，存放于15ml無菌離心管內(nèi)。

1.2.2 FISH檢測：主要的設(shè)備和試劑見表1。

（1）FISH 探針：A組探針：GLP21（紅色）探針為21q22區(qū)特異性探針；GLP13（綠色）探針為13q14區(qū)特異性探針。B組探針：CSPY（紅色）探針為Y型染色體上著絲粒探針；CSPX探針為X型染色體上著絲粒探針，CSP探針為18號染色體上著絲粒探針。（2）FISH篩選步驟：①制備樣品玻片：收集離心細(xì)胞，去掉上清液，膠原酶B水解，低滲KCL溶液溫育，固定，去掉上清制備成懸浮液，滴片且老化。②預(yù)處理玻片：經(jīng)SSC溶液清洗，胃蛋白溶液水解10min，再經(jīng)SSC溶液清洗，于梯度酒精中脫水，自行干燥。③變性雜交：配備探針，離心后，于玻片雜交部位滴加10μl探針混合物，迅速蓋上蓋玻片，經(jīng)橡皮膠密封邊緣，75℃下共變性5min，42℃下雜交，放置過夜。④洗滌玻片：經(jīng)SSC溶液和酒精漂洗。⑤復(fù)染：于避光處自行干燥，用DAPI復(fù)染劑進(jìn)行復(fù)染，放置于避光處。（3）觀察和判斷FISH檢測結(jié)果：隨機(jī)計數(shù)羊水細(xì)胞超過50個，針對染色體正常細(xì)胞核，GLP21（紅色）／GLP13（綠色）探針雜交后可觀察到2個紅色指示信號和2個綠色指示信號；CSPY（紅色）／CSPX（綠色）／CSP18（湖藍(lán)色）探針可觀察到1個紅色指示信號（男性）、1個綠色和2個湖藍(lán)色指示信號，或者2個綠色指示信號、2個湖藍(lán)色指示信號。評價標(biāo)準(zhǔn)：①正常：超過90%的細(xì)胞顯示出正常類型的信號。②異常：超過60%的細(xì)胞顯示出異常類型的信號。③無法判別：計數(shù)細(xì)胞增加至100個，判斷最終結(jié)果。

表1 FISH檢測所用的主要設(shè)備和儀器

2 結(jié)果

1500例孕婦經(jīng)FISH技術(shù)檢驗其羊水細(xì)胞中X、Y、13、18、215種染色體，其中1462例胎兒染色體數(shù)目并無異常，38例胎兒染色體數(shù)目異常，其中27例胎兒診斷為21－三體綜合征；6例為18－三體綜合征；2例為13－三體綜合征；1例為45，XO（特納綜合征）；1例47，XXY；1例47，XYY；見表2。所有FISH檢測結(jié)果均符合經(jīng)培養(yǎng)的羊水細(xì)胞染色體類型驗證結(jié)果，21－三體經(jīng)引產(chǎn)后臍血細(xì)胞染色體類型證實。

表2 FISH技術(shù)檢測染色體異常結(jié)果

3 討論

目前70%的先天性缺陷均由遺傳物質(zhì)引起，其中多見為染色體數(shù)目異常［4］。21－三體綜合征（唐氏綜合征）的臨床表現(xiàn)主要為患兒智力降低、發(fā)育緩慢、面容特殊，伴隨多發(fā)畸形，是一種較為普遍且嚴(yán)重的先天性智力低下疾?。?］。其次為Edward’s綜合征，即18－三體綜合征，臨床主要的癥狀為常發(fā)畸形，新生兒娩出后數(shù)周夭折［6］。唐氏綜合征胎兒平均生存時間僅為70d，幸存者存在智力低下、發(fā)育生長緩慢、畸形等異常情況［7］。性染色體（X和Y染色體）數(shù)目異常的普遍疾病為47，XXX（三倍體－X綜合征）綜合征、45，XO（特納綜合征）、47，XYY綜合征以及47，XXY綜合征等。目前尚無辦法治療染色體疾病，此病對整個家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)和精神壓力，因此快速診斷胎兒染色體數(shù)目異常具有重要意義。

近些年來，國內(nèi)多采用甲胎蛋白、游離雌三醇、人絨毛膜促性腺激素β亞單位三者聯(lián)合的血清學(xué)篩選，結(jié)合產(chǎn)婦孕周及年齡初步診斷21－三體綜合征和18－三體綜合征，利用羊水細(xì)胞或者臍帶血細(xì)胞的染色體分型驗證為診斷的黃金準(zhǔn)則。血清學(xué)檢驗費用低、速度快，臨床上較為多用，然而其有假陽性高和假陰性高的缺陷［8］。培養(yǎng)羊水細(xì)胞需耗費較長時間，且易出現(xiàn)污染而造成培養(yǎng)失敗，此外臍靜脈的穿刺需具備較高的技術(shù)水準(zhǔn)。因而，急切需要找到一種簡單、方便，還能準(zhǔn)確、快速診斷羊水細(xì)胞的科學(xué)技術(shù)以解決上述問題。在上個世紀(jì)末FISH技術(shù)順勢而生。這種技術(shù)利用直接或者間接經(jīng)熒光標(biāo)記的特異性DNA探針與目標(biāo)細(xì)胞中相同序列的DNA雜交，可定量及定位分析目標(biāo)DNA片段或者基因。鑒于每一種DNA探針僅能檢驗一種對應(yīng)的DNA且顯色，借助統(tǒng)計信號數(shù)目能夠辨識對應(yīng)染色體數(shù)目。與染色體類型檢驗比較，F(xiàn)ISH技術(shù)具操作簡單、檢驗快、特異性強(qiáng)、結(jié)果顯著、成功率高、樣本需要量少、診斷準(zhǔn)確等優(yōu)勢，此外，F(xiàn)ISH技術(shù)不僅能夠檢測分裂中期染色體，還可檢測分裂間期染色體［9］。文獻(xiàn)資料［10，11］提出其與染色體核型常規(guī)性分析結(jié)果的吻合率高達(dá)99.8%。本組分析結(jié)果檢驗出38例染色體遺傳物質(zhì)數(shù)量異常胎兒，其中27例胎兒診斷為21－三體綜合征，占71.05%；6例為18－三體綜合征，占15.79%；2例為13－三體綜合征，占5.26%；性染色體數(shù)目異常分別為1例為45，XO（特納綜合征），占2.63%；1例47，XXY，占2.63%；1例47，XYY，占為2.63%。本文結(jié)果顯示，診斷為染色體數(shù)量異常的胎兒中，21－三體綜合征胎兒所占比例最大，其次為18－三體綜合征胎兒，再者為13－三體綜合征胎兒，符合臨床染色體數(shù)目異常導(dǎo)致的疾病發(fā)病率。FISH檢測糾正了單純依賴于細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)行診斷胎兒染色體數(shù)目異常的局限性和缺陷，防止了培養(yǎng)羊水細(xì)胞而導(dǎo)致的檢查失敗。本組對象中6例分娩過21－三體綜合征胎兒的產(chǎn)婦，經(jīng)FISH檢測聯(lián)合染色體類型驗證，F(xiàn)ISH篩選結(jié)果均無異常，染色體類型驗證結(jié)果顯示1例為染色體出現(xiàn)易位；2例夫妻兩方自身染色體數(shù)目異常，或者分娩過染色數(shù)目異常胎兒的產(chǎn)婦，依舊要給予羊水細(xì)胞染色體類型驗證，避免漏診。

嚴(yán)重制約我國經(jīng)濟(jì)水平提高，影響人口素質(zhì)的問題之一就是出生缺陷。因此，應(yīng)高度重視對加大產(chǎn)前快速診斷胎兒染色體數(shù)目異常的研究、應(yīng)用和推廣。相比于常規(guī)羊水細(xì)胞或者臍帶血細(xì)胞染色體類型驗證結(jié)果，F(xiàn)ISH技術(shù)有著操作簡便、特異度高、靈敏性強(qiáng)、快速診斷等特征，滿足臨床實際工作的需求。綜上所述，在產(chǎn)前快速診斷胎兒染色體數(shù)目的異常中應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)，有較高的成功率和準(zhǔn)確率，可在臨床上予以推廣應(yīng)用。

［1］趙煒，俞冬熠，張凱.羊水細(xì)胞培養(yǎng)及熒光原位雜交技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用〔J〕.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013，（4）：57－59.

［2］石鑫瑋，劉海意，喬福元，等.熒光原位雜交技術(shù)及染色體核型分析在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值〔J〕.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2011，27（2）：125－127.

［3］Qian J，Jenkins RB，Bostwick DG.Genetic and chromosomal alterations in prostatic intraepithelial neoplasia and carcinoma detected by fluorescence in situ hybridization〔J〕.European Urology，2012，35（5－6）：479－483.

［4］Lau TK，Chen F，Pan X，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of common fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma DNA sequencing〔J〕.Journal of Maternal－Fetal and Neonatal Medicine，2012，25（8）：1370－1374.

［5］Ho SSY，Chua C，Gole L，et al.Same－day prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies using microfluidics－fluorescence in situ hybridization〔J〕.Prenatal Diagnosis，2012，32（4）：321－328.

［6］姜淑芳，高志英，盧彥平，等.熒光染色體原位雜交技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37（7）：711－714.

［7］傅文婷，潘小英，尹愛華，等.熒光原位雜交技術(shù)在胎兒染色體異常產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用〔J〕.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19（9）：41－42.

［8］唐新華，朱姝，蘇潔，等.FISH技術(shù)快速診斷胎兒染色體數(shù)目異?！睯〕.中國婦幼保健，2010，25（26）：3810－3813.

［9］宋蘭林，熊麗，劉思平，等.FISH技術(shù)在快速診斷自然流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目異常中的應(yīng)用〔J〕.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，31（9）：1605－1607.

［10］吳清明，周瑾.FISH產(chǎn)前診斷非整倍體染色體病的應(yīng)用分析〔J〕.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013，（9）：31－32.

［11］宋婕萍，王波，徐淑琴，等.熒光原位雜交技術(shù)在胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（1）：111－113.