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        微弱熒光信號下對色氨酸和酪氨酸溶液的定量分析

        2014-08-01 09:58:22高海闊馬盛楠
        關(guān)鍵詞:色氨酸酪氨酸預(yù)處理

        高海闊,馬盛楠

        (1.濱州學(xué)院 光電工程系;2.濱州學(xué)院 外語系,山東 濱州 256600)

        微弱熒光信號下對色氨酸和酪氨酸溶液的定量分析

        高海闊1,馬盛楠2

        (1.濱州學(xué)院 光電工程系;2.濱州學(xué)院 外語系,山東 濱州 256600)

        應(yīng)用偏最小二乘法,研究了在微弱熒光信號情況下不同的預(yù)處理方式和不同建模光譜區(qū)間對色氨酸和酪氨酸溶液濃度定量分析結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)預(yù)處理方式采用平滑、減黑暗響應(yīng)和減直線操作,然后建模光譜區(qū)間采用300-500nm范圍內(nèi)取極值點并對300-400nm進(jìn)行間隔10nm取值時得到最佳的建模效果.實驗最終取得了良好的預(yù)測效果:酪氨酸濃度的平均預(yù)測誤差為5.9%,色氨酸濃度的平均誤差為8.1%.

        偏最小二乘法;熒光光譜;定量分析

        在天然氨基酸中,能夠在激發(fā)光照射下發(fā)射熒光的只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸.色氨酸作為人體的必須氨基酸之一,具有極其重要的生理功能,在醫(yī)學(xué)上可用于抗痙攣,在食品中常用作抗氧化劑;酪氨酸則在機(jī)體內(nèi)起激素和激素受體作用,與神經(jīng)活動、行為以及大腦皮層的睡眠節(jié)律有關(guān).因此,利用它們的熒光特性來測定其含量具有重要的意義.然而由于氨基酸溶液濃度、測量條件等限制,熒光的信號是非常微弱的[1-3].利用微弱熒光信號實現(xiàn)對氨基酸溶液濃度同時測定一直是分析工作者的難題之一.

        目前,光譜定量分析的方法主要有多元線性回歸(MLR)、逐步回歸(SMR),主成分回歸(PCR)、偏最小二乘法(PLS)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)和拓?fù)洌═opological)等.本文采用經(jīng)典的偏最小二乘法對所獲取的微弱的熒光光譜信號進(jìn)行定量分析,同時測定了色氨酸和酪氨酸的濃度,取得了滿意的效果.

        1 偏最小二乘法方法原理

        設(shè)有q個因變量{y1,…,yq}和p自變量{x1,…,xp}.為了研究因變量和自變量的統(tǒng)計關(guān)系,我們觀測了n個樣本點,由此構(gòu)成了自變量與因變量的數(shù)據(jù)表X={x1,…,xp}和Y={y1,…,yq}.偏最小二乘回歸分別在X與Y中提取出成分t1和u1(也就是說,t1是x1,…, xp的線形組合,u1是y1,…,yq的線形組合).在提取這兩個成分時,為了回歸分析的需要,有下列兩個要求[4]:

        (1)t1和u1應(yīng)盡可能大地攜帶他們各自數(shù)據(jù)表中的變異信息;

        (2)t1與u1的相關(guān)程度能夠達(dá)到最大.

        這兩個要求表明,t1和u1應(yīng)盡可能充分的代表數(shù)據(jù)表X和Y,同時自變量的成分t1對因變量的成分u1又有最強(qiáng)的解釋能力[5].

        在第一個成分t1和u1被提取后,偏最小二乘回歸分別實施X對t1的回歸以及Y對u1的回歸.如果回歸方程已經(jīng)達(dá)到滿意的精度,則算法終止;否則,將利用X被t1解釋后的殘余信息以及Y被u1解釋后的殘余信息進(jìn)行第二輪的成分提取[6].如此往復(fù),直到能達(dá)到一個較滿意的精度為止.若最終對X共提取了m個成分t1,Λ,tm,偏最小二乘回歸將通過實施yk對t1,Λ,tm的回歸,然后再表達(dá)成yk關(guān)于原變量X1,Λ,Xm的回歸方程,k=1,2,…,q.

        2 實驗部分

        2.1 樣品準(zhǔn)備

        預(yù)先配制各種濃度的酪氨酸和色氨酸的溶液作為測試目標(biāo),其濃度如表1所示.

        2.2 .試驗系統(tǒng)的組成

        本實驗采用 AvaSpec-2048型光譜儀. AvaSpec-2048型光纖光譜儀基于AvaBench-75光學(xué)平臺,采用對稱Czerny-Turner光路設(shè)計,帶有2048個像素的SONY第二代CCD探測器.光譜儀包括光纖接頭(標(biāo)準(zhǔn)SMA接口,也可以選擇其它類型的接口)、準(zhǔn)直鏡、聚焦鏡和衍射光柵. AvaSpec-2048測 量 波 長 范 圍 200-1100nm,AvaSpec-2048型光譜儀適合低亮度和高分辨率的應(yīng)用領(lǐng)域.

        表1 配置的酪氨酸和色氨酸的濃度(單位:1*10-4g/m l)

        激發(fā)波長采用254nm,由紫外燈加254nm的濾光片配合實現(xiàn).

        熒光器皿為北京金格蘭公司生產(chǎn)的石英燒杯.

        2.3 光譜預(yù)處理方法

        光譜預(yù)處理即數(shù)據(jù)預(yù)處理是進(jìn)行建模的一個重要階段,對每一個建模樣品,通常要用多張譜圖確定其重復(fù)性.如果同一樣品的譜圖不能被鑒定,必須用數(shù)據(jù)預(yù)處理方法使它們比較相似,以消除偏移或不同線性基線的變化.通過預(yù)處理數(shù)據(jù),保證光譜數(shù)據(jù)和含量值之間很好的相關(guān)性.一般情況下,無法給出一個常用的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法或最適合的數(shù)據(jù)方法,而是去比較幾種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法,從中找出最優(yōu)方法.

        所測熒光信號的強(qiáng)度極其微弱,我們從直接測得的信號中很難看出熒光信號,信號全部被淹沒在噪聲中,如圖1(a)所示.

        考慮到儀器本身的影響,我們在完全黑暗的情況下測得儀器的響應(yīng)(以下簡稱黑暗相應(yīng)),用原始信號減去黑暗響應(yīng)可得圖1(b).從圖1(b)中可以看出,光譜圖的幅值大幅度減小,說明我們有效地降低了噪聲的影響,再對上述結(jié)果做多次平滑處理,得到圖1(c).

        從該圖中我們基本可以看清特征峰的位置,但明顯的有基線漂移的現(xiàn)象存在,我們對各光譜做減去一條直線的處理得圖1(d);為了更好地去除基線平移的影響,我們在對其做求一次求導(dǎo)處理,得圖1(e);二次求導(dǎo)可以消除基線漂移的影響,經(jīng)過二次求導(dǎo)后,可得到如圖1(f)所示波形.

        校正模型的建立是在比較各種分析方法的基礎(chǔ)上逐步得到改善的,試驗首先進(jìn)行了光譜預(yù)處理方法對校正結(jié)果的比較研究,主成分?jǐn)?shù)我們采用預(yù)測誤差平方和最小時的主成分?jǐn)?shù),光譜范圍采用300-700nm,間隔20nm取值.具體結(jié)果如下:

        表2 預(yù)處理方法對建模結(jié)果的影響

        圖1 各種預(yù)處理方法對譜形的影響

        從實驗結(jié)果可以看出,試驗在經(jīng)過平滑、減黑暗響應(yīng)和減直線操作時的建模效果最好.從表2中的對比結(jié)果也可以看出,對樣品進(jìn)行的建模效果的好壞不是由一個特定的方法來確定的.有的處理方法可以改善建模效果,但有的方法不僅不能促進(jìn)建模效果,而且可能由于本身處理的特點而帶入噪聲等其他信息,使建模效果降低.因此,建模時應(yīng)根據(jù)不同檢測目的、樣品狀態(tài)、儀器性能等情況,選擇適宜的數(shù)據(jù)處理方法,以期獲得最佳建模效果.

        2.4 光譜范圍的選擇

        我們在對原始光譜做平滑、減黑暗響應(yīng)和減直線操作的基礎(chǔ)上,進(jìn)行區(qū)間范圍選擇比較研究,根據(jù)試驗結(jié)果分析光譜區(qū)選擇對校正結(jié)果的影響情況.

        仍采用預(yù)測殘差平方和最小時的主成分?jǐn)?shù).選擇區(qū)間如下:300-1000nm區(qū)間間隔50nm取值、300-700nm區(qū)間間隔30nm取值、300-500nm區(qū)間間隔 25nm取值、300-500nm區(qū)間取極值點、300-500nm區(qū)間取極值點+300-400nm間隔10nm取值.

        從表3可以看出,在經(jīng)過300-500nm范圍內(nèi)取極值點,再對300-400nm進(jìn)行間隔10nm取值時具有最好的建模效果.具體結(jié)果如表4.而酪氨酸和色氨酸在254nm波長輻射激發(fā)的主要譜形都落在300-500nm范圍內(nèi),因此這樣取值具有很好的合理性.

        表3 建模區(qū)間對建模效果的影響

        表4 偏最小二乘法在最優(yōu)建模區(qū)間時的建模結(jié)果

        酪氨酸濃度的平均預(yù)測誤差為5.9%,色氨酸濃度的平均誤差為8.1%.

        3 結(jié)論

        一定濃度的酪氨酸和色氨酸的混合溶液在254nm激發(fā)波長的激發(fā)下發(fā)出極其微弱的熒光,本文基于傳統(tǒng)的偏最小二乘法,嘗試各種預(yù)處理方法和光譜范圍對該微弱的熒光光譜信號進(jìn)行處理,并取得了良好的預(yù)測效果.預(yù)處理方式采用平滑、減黑暗響應(yīng)和減直線操作,然后建模光譜區(qū)間采用300-500nm范圍內(nèi)取極值點并對300-400nm進(jìn)行間隔10nm取值時取得最佳的建模效果:酪氨酸濃度的平均預(yù)測誤差為5.9%,色氨酸濃度的平均誤差為8.1%.

        〔1〕V.I.Tom in.Separation of a weak fluorescence signal of 3-hydroxyflavone using dynamic quenching[J].Optics and Spectroscopy,2009,Vol. 106,No.3:355-358.

        〔2〕Jing-Jing W u,Yu-W en Liu,M eng-Xiang Sun. Improved and high throughput quantitative measurements of weak GFP expression in transgenic plant materials[J].Plant Cell Reports, 2011,30:1253-1260.

        〔3〕Huili W ang,Jingwen M ao,Ailian Duan et al. Fluorescence Quenching of 4-tert-Octylphenol by Room Temperature Ionic Liquids and its Application[J].Journal of Fluorescence,2013,23: 323-331.

        〔4〕Songhui Wang,Bingren Xiang,Yilong Su.Direct determ ination of dichlorvos in water by partial least square-discrim inant analysis[J].Environmental Chem istry Letters,2012,10:383–387.

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        O657.3

        A

        1673-260X(2014)04-0007-03

        濱州學(xué)院科研基金項目(BZXYQNLG201106)

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