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        微弱熒光信號下對色氨酸和酪氨酸溶液的定量分析

        2014-08-01 09:58:22高海闊馬盛楠
        赤峰學院學報·自然科學版 2014年8期
        關鍵詞:色氨酸酪氨酸預處理

        高海闊,馬盛楠

        (1.濱州學院 光電工程系;2.濱州學院 外語系,山東 濱州 256600)

        微弱熒光信號下對色氨酸和酪氨酸溶液的定量分析

        高海闊1,馬盛楠2

        (1.濱州學院 光電工程系;2.濱州學院 外語系,山東 濱州 256600)

        應用偏最小二乘法,研究了在微弱熒光信號情況下不同的預處理方式和不同建模光譜區(qū)間對色氨酸和酪氨酸溶液濃度定量分析結果的影響,發(fā)現(xiàn)預處理方式采用平滑、減黑暗響應和減直線操作,然后建模光譜區(qū)間采用300-500nm范圍內取極值點并對300-400nm進行間隔10nm取值時得到最佳的建模效果.實驗最終取得了良好的預測效果:酪氨酸濃度的平均預測誤差為5.9%,色氨酸濃度的平均誤差為8.1%.

        偏最小二乘法;熒光光譜;定量分析

        在天然氨基酸中,能夠在激發(fā)光照射下發(fā)射熒光的只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸.色氨酸作為人體的必須氨基酸之一,具有極其重要的生理功能,在醫(yī)學上可用于抗痙攣,在食品中常用作抗氧化劑;酪氨酸則在機體內起激素和激素受體作用,與神經活動、行為以及大腦皮層的睡眠節(jié)律有關.因此,利用它們的熒光特性來測定其含量具有重要的意義.然而由于氨基酸溶液濃度、測量條件等限制,熒光的信號是非常微弱的[1-3].利用微弱熒光信號實現(xiàn)對氨基酸溶液濃度同時測定一直是分析工作者的難題之一.

        目前,光譜定量分析的方法主要有多元線性回歸(MLR)、逐步回歸(SMR),主成分回歸(PCR)、偏最小二乘法(PLS)、人工神經網絡(ANN)和拓撲(Topological)等.本文采用經典的偏最小二乘法對所獲取的微弱的熒光光譜信號進行定量分析,同時測定了色氨酸和酪氨酸的濃度,取得了滿意的效果.

        1 偏最小二乘法方法原理

        設有q個因變量{y1,…,yq}和p自變量{x1,…,xp}.為了研究因變量和自變量的統(tǒng)計關系,我們觀測了n個樣本點,由此構成了自變量與因變量的數據表X={x1,…,xp}和Y={y1,…,yq}.偏最小二乘回歸分別在X與Y中提取出成分t1和u1(也就是說,t1是x1,…, xp的線形組合,u1是y1,…,yq的線形組合).在提取這兩個成分時,為了回歸分析的需要,有下列兩個要求[4]:

        (1)t1和u1應盡可能大地攜帶他們各自數據表中的變異信息;

        (2)t1與u1的相關程度能夠達到最大.

        這兩個要求表明,t1和u1應盡可能充分的代表數據表X和Y,同時自變量的成分t1對因變量的成分u1又有最強的解釋能力[5].

        在第一個成分t1和u1被提取后,偏最小二乘回歸分別實施X對t1的回歸以及Y對u1的回歸.如果回歸方程已經達到滿意的精度,則算法終止;否則,將利用X被t1解釋后的殘余信息以及Y被u1解釋后的殘余信息進行第二輪的成分提取[6].如此往復,直到能達到一個較滿意的精度為止.若最終對X共提取了m個成分t1,Λ,tm,偏最小二乘回歸將通過實施yk對t1,Λ,tm的回歸,然后再表達成yk關于原變量X1,Λ,Xm的回歸方程,k=1,2,…,q.

        2 實驗部分

        2.1 樣品準備

        預先配制各種濃度的酪氨酸和色氨酸的溶液作為測試目標,其濃度如表1所示.

        2.2 .試驗系統(tǒng)的組成

        本實驗采用 AvaSpec-2048型光譜儀. AvaSpec-2048型光纖光譜儀基于AvaBench-75光學平臺,采用對稱Czerny-Turner光路設計,帶有2048個像素的SONY第二代CCD探測器.光譜儀包括光纖接頭(標準SMA接口,也可以選擇其它類型的接口)、準直鏡、聚焦鏡和衍射光柵. AvaSpec-2048測 量 波 長 范 圍 200-1100nm,AvaSpec-2048型光譜儀適合低亮度和高分辨率的應用領域.

        表1 配置的酪氨酸和色氨酸的濃度(單位:1*10-4g/m l)

        激發(fā)波長采用254nm,由紫外燈加254nm的濾光片配合實現(xiàn).

        熒光器皿為北京金格蘭公司生產的石英燒杯.

        2.3 光譜預處理方法

        光譜預處理即數據預處理是進行建模的一個重要階段,對每一個建模樣品,通常要用多張譜圖確定其重復性.如果同一樣品的譜圖不能被鑒定,必須用數據預處理方法使它們比較相似,以消除偏移或不同線性基線的變化.通過預處理數據,保證光譜數據和含量值之間很好的相關性.一般情況下,無法給出一個常用的數據預處理方法或最適合的數據方法,而是去比較幾種數據預處理方法,從中找出最優(yōu)方法.

        所測熒光信號的強度極其微弱,我們從直接測得的信號中很難看出熒光信號,信號全部被淹沒在噪聲中,如圖1(a)所示.

        考慮到儀器本身的影響,我們在完全黑暗的情況下測得儀器的響應(以下簡稱黑暗相應),用原始信號減去黑暗響應可得圖1(b).從圖1(b)中可以看出,光譜圖的幅值大幅度減小,說明我們有效地降低了噪聲的影響,再對上述結果做多次平滑處理,得到圖1(c).

        從該圖中我們基本可以看清特征峰的位置,但明顯的有基線漂移的現(xiàn)象存在,我們對各光譜做減去一條直線的處理得圖1(d);為了更好地去除基線平移的影響,我們在對其做求一次求導處理,得圖1(e);二次求導可以消除基線漂移的影響,經過二次求導后,可得到如圖1(f)所示波形.

        校正模型的建立是在比較各種分析方法的基礎上逐步得到改善的,試驗首先進行了光譜預處理方法對校正結果的比較研究,主成分數我們采用預測誤差平方和最小時的主成分數,光譜范圍采用300-700nm,間隔20nm取值.具體結果如下:

        表2 預處理方法對建模結果的影響

        圖1 各種預處理方法對譜形的影響

        從實驗結果可以看出,試驗在經過平滑、減黑暗響應和減直線操作時的建模效果最好.從表2中的對比結果也可以看出,對樣品進行的建模效果的好壞不是由一個特定的方法來確定的.有的處理方法可以改善建模效果,但有的方法不僅不能促進建模效果,而且可能由于本身處理的特點而帶入噪聲等其他信息,使建模效果降低.因此,建模時應根據不同檢測目的、樣品狀態(tài)、儀器性能等情況,選擇適宜的數據處理方法,以期獲得最佳建模效果.

        2.4 光譜范圍的選擇

        我們在對原始光譜做平滑、減黑暗響應和減直線操作的基礎上,進行區(qū)間范圍選擇比較研究,根據試驗結果分析光譜區(qū)選擇對校正結果的影響情況.

        仍采用預測殘差平方和最小時的主成分數.選擇區(qū)間如下:300-1000nm區(qū)間間隔50nm取值、300-700nm區(qū)間間隔30nm取值、300-500nm區(qū)間間隔 25nm取值、300-500nm區(qū)間取極值點、300-500nm區(qū)間取極值點+300-400nm間隔10nm取值.

        從表3可以看出,在經過300-500nm范圍內取極值點,再對300-400nm進行間隔10nm取值時具有最好的建模效果.具體結果如表4.而酪氨酸和色氨酸在254nm波長輻射激發(fā)的主要譜形都落在300-500nm范圍內,因此這樣取值具有很好的合理性.

        表3 建模區(qū)間對建模效果的影響

        表4 偏最小二乘法在最優(yōu)建模區(qū)間時的建模結果

        酪氨酸濃度的平均預測誤差為5.9%,色氨酸濃度的平均誤差為8.1%.

        3 結論

        一定濃度的酪氨酸和色氨酸的混合溶液在254nm激發(fā)波長的激發(fā)下發(fā)出極其微弱的熒光,本文基于傳統(tǒng)的偏最小二乘法,嘗試各種預處理方法和光譜范圍對該微弱的熒光光譜信號進行處理,并取得了良好的預測效果.預處理方式采用平滑、減黑暗響應和減直線操作,然后建模光譜區(qū)間采用300-500nm范圍內取極值點并對300-400nm進行間隔10nm取值時取得最佳的建模效果:酪氨酸濃度的平均預測誤差為5.9%,色氨酸濃度的平均誤差為8.1%.

        〔1〕V.I.Tom in.Separation of a weak fluorescence signal of 3-hydroxyflavone using dynamic quenching[J].Optics and Spectroscopy,2009,Vol. 106,No.3:355-358.

        〔2〕Jing-Jing W u,Yu-W en Liu,M eng-Xiang Sun. Improved and high throughput quantitative measurements of weak GFP expression in transgenic plant materials[J].Plant Cell Reports, 2011,30:1253-1260.

        〔3〕Huili W ang,Jingwen M ao,Ailian Duan et al. Fluorescence Quenching of 4-tert-Octylphenol by Room Temperature Ionic Liquids and its Application[J].Journal of Fluorescence,2013,23: 323-331.

        〔4〕Songhui Wang,Bingren Xiang,Yilong Su.Direct determ ination of dichlorvos in water by partial least square-discrim inant analysis[J].Environmental Chem istry Letters,2012,10:383–387.

        〔5〕Kanchan Upadhyay,Anupama Asthana,Neetu Tiwari et al.Determ ination of nimesulide in pharmaceutical and biological samples by a spectrophotometric method assisted w ith the partial least square method [J].Research on Chem ical Intermediates,2013,39:3553–3563.

        〔6〕Sun Ok Choi,Seok Ho Lee,Hea-Young et al. Prediction on the chiral behaviors of drugs w ith am ine moiety on the chiral cellobiohydrolase stationary phase using a partial least square method[J].Archives of Pharmacal Research,2004,10:1009-1015.

        O657.3

        A

        1673-260X(2014)04-0007-03

        濱州學院科研基金項目(BZXYQNLG201106)

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