關(guān)桂英 王風(fēng)朝

不同分子生物學(xué)方法檢測(cè)手足口病標(biāo)本的應(yīng)用分析

關(guān)桂英 王風(fēng)朝

目的 比較不同分子生物學(xué)方法檢測(cè)手足口病標(biāo)本的敏感性及應(yīng)用價(jià)值。方法 選取山東莘縣疾病預(yù)防控制中心2012年1月～2013年8月收集的100例手足口病標(biāo)本為研究對(duì)象，根據(jù)分子生物學(xué)檢測(cè)方法不同，將其分為巢式PCR組、一步法RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）組及實(shí)時(shí)RT-PCR組，對(duì)3組腸道病毒71型檢測(cè)陽(yáng)性率結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 巢式PCR對(duì)住院標(biāo)本、輕癥標(biāo)本及重死標(biāo)本檢測(cè)的EV71陽(yáng)性率分別為84.62%、25%及83.33%，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)的80.77%、23.31%及77.78%，均明顯高于一步法RT-PCR檢測(cè)的15.38%、8.92%、44.44%，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。結(jié)論 手足口病原體主要是EV71及CA16，且巢式PCR和實(shí)時(shí)RT-PCR生物檢測(cè)敏感性相對(duì)一步法RT-PCR要高。

手足口??；巢式PCR；一步法；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

手足口病作為臨床上一種常見(jiàn)傳染疾病，多發(fā)病于兒童，特別是不足三歲的嬰幼兒，易引發(fā)肺水腫、腦炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重者甚至死亡[1]。相關(guān)研究表明，腸道病毒71型（EV71）是引發(fā)手足口病的主要病原體，此外該病毒還易引起腦炎、無(wú)菌性腦膜炎等，危害性大[2]。本研究就此對(duì)本市人民醫(yī)院100例手足口病標(biāo)本采取3種不同分子生物學(xué)檢測(cè)腸道病毒71型，比較不同分子生物學(xué)檢測(cè)手足口病的敏感性及特點(diǎn)，為感染EV71的患兒及時(shí)治療提供重要依據(jù)，報(bào)道具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取山東莘縣疾病預(yù)防控制中心2012年1月～2013年8月收集的100例手足口病標(biāo)本為研究對(duì)象，其中住院患者標(biāo)本26例，輕癥患者標(biāo)本56例，重死患者標(biāo)本18例。所有標(biāo)本患者均符合《手足口病診療指南》[3]中對(duì)手足口病制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）發(fā)熱；（2）皮疹，且足底等部位出現(xiàn)水泡等癥狀；（3）口腔潰瘍；（4）中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)癥狀。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 實(shí)行無(wú)菌操作，手足口病患者發(fā)病后3～7d內(nèi)采集1～2g糞便，保存在消毒滅菌后的專用盒內(nèi)。利用干棉簽對(duì)患者鼻咽部位進(jìn)行正確的擦拭，采集完畢后馬上放入專用試管中。上述標(biāo)本均保存在-80℃冰箱中。

1.2.2 標(biāo)本檢測(cè) 嚴(yán)格按照病毒核酸提取試劑使用說(shuō)明書(shū)操作，提取病毒。根據(jù)GenBank中常見(jiàn)EV端相關(guān)基因序列選擇合理的引物，并利用相關(guān)軟件輔助對(duì)腸道病毒VP1-VP3間進(jìn)行EV71及CA16（腸道病毒柯薩奇）引物序列排列，不同引物產(chǎn)生不同的產(chǎn)物。對(duì)手足口病標(biāo)本分別進(jìn)行巢式PCR、一步法RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）及實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)。RT-PCR反應(yīng)條件：45攝氏度逆轉(zhuǎn)錄45min，94℃預(yù)變性2min/變性20s，45℃退火25s，然后72℃延伸30s，計(jì)36個(gè)循環(huán)。巢式PCR反應(yīng)條件如上。實(shí)行病毒陽(yáng)性率和陰性率對(duì)比試驗(yàn)，共試驗(yàn)3次。

巢式PCR及一步法RT-PCR采用瓊脂糖凝膠電泳（1.5%）分析結(jié)果，實(shí)時(shí)RT-PCR利用熒光自動(dòng)檢測(cè)儀分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析所得數(shù)據(jù)，正態(tài)計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3組方法手足口病標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果具體見(jiàn)表1。住院及重死標(biāo)本中主要感染病毒為EV71，輕癥標(biāo)本主要感染病毒為CA16。且巢式PCR組EV71陽(yáng)性率為：住院患者標(biāo)本84.6%，輕癥患者標(biāo)本25%，重死患者標(biāo)本83.33%；一步法RT-PCR組EV71陽(yáng)性率為：住院患者標(biāo)本15.38%，輕癥患者標(biāo)本8.92%，重死患者標(biāo)本44.44%；實(shí)時(shí)RT-PCR組EV71陽(yáng)性率為：住院患者標(biāo)本80.77%，輕癥患者標(biāo)本23.21%，重死患者標(biāo)本77.78%。巢式PCR及實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)敏感性明顯高于一步法RT-PCT方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 3種不同分子生物學(xué)方法檢測(cè)手足口病陽(yáng)性結(jié)果比較［n(%)］

3 討論

最早在1957年就有人詳細(xì)介紹過(guò)手足口病，次年相關(guān)研究人員從手足口病患者中分離出CA16[4]，隨后1974年美國(guó)學(xué)者從腦炎患者標(biāo)本中分離出EV71，自此臨床上認(rèn)為手足口病的主要病原體為CA16和EV71[5]。目前臨床上檢測(cè)手足口病的分子生物方法主要有巢式PCR、一步法RT-PCR及實(shí)時(shí)RT-PCR等，且不同分子生物學(xué)方法對(duì)手足口病標(biāo)本檢測(cè)的敏感性、特異性等是不同的[6]。

本研究對(duì)100例手足口病標(biāo)本采取上述3種不同分子生物學(xué)方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，巢式PCR對(duì)住院標(biāo)本、輕癥標(biāo)本及重死標(biāo)本檢測(cè)的EV71陽(yáng)性率分別為84.62%、25%及83.33%，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)的80.77%、23.31%及77.78%，均明顯高于一步法RT-PCR檢測(cè)的15.38%、8.92%、44.44%。一步法RT-PCR指的是將其中一條RNA鏈進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，之后再以新形成的DNA鏈通過(guò)PCR進(jìn)行復(fù)制[7]，以達(dá)到擴(kuò)增的目的。實(shí)時(shí)RT-PCR則是在一定時(shí)間內(nèi)通過(guò)DNA的增幅來(lái)進(jìn)行定量分析。而巢式PCR共分為兩步，第一步是將目標(biāo)DNA模板藍(lán)色的第一對(duì)引物結(jié)合起來(lái)，得到目的片段，第二步是使用第二套引物對(duì)第一步中經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物再次進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。由于第一套引物在PCR產(chǎn)物的內(nèi)部，而非目的片斷一般不會(huì)同時(shí)包含兩套引物，第二步的擴(kuò)增過(guò)程中不會(huì)有非目的片段被擴(kuò)增[8]。所以改種方法不會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增所引發(fā)的污染問(wèn)題，特異性較高，是目前擴(kuò)增質(zhì)量最高并且監(jiān)測(cè)效果最好的一種方法。所得結(jié)果也與相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)論一致。

由此可知，巢式PCR檢測(cè)以及實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性明顯高于一步法RT-PCR，均可作為手足口病標(biāo)本檢測(cè)的重要手段。

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[2] 宮相翠,徐元芹,蔣艷，等.EV71相關(guān)手足口病合并肺水腫的體液免疫作用[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(28):92-93.

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[6] 張榮強(qiáng),侯佩強(qiáng),倪楠，等.泰安市2010～2012年手足口病不同標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果分析[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,4(10):248-251.

[7] 周建芳,陳嘉臻,繆忻余，等.2010～2012年浙江省奉化市231例手足口病病原監(jiān)測(cè)結(jié)果及病毒聚類分析[J].中國(guó)病毒病雜志,2013, 4(4):284-289.

[8] 吳世嘉.基于上轉(zhuǎn)換熒光納米探針的高靈敏微生物毒素檢測(cè)方法研究[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2013：25-26.

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.22.102

山東 252400 山東莘縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科 （關(guān)桂英王風(fēng)朝）