張洪俠，周桂桐，郭茂娟，張 敏，胡先同，姜希娟△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.泰安市婦幼保健院，山東泰安271000)

大量研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)損傷與抗損傷的慢性炎癥過(guò)程，從脂質(zhì)條紋到纖維斑塊和粥樣斑塊，再到不穩(wěn)定斑塊的破裂和血栓形成，都有各種炎癥細(xì)胞和炎癥因子的參與［1－2］。AS斑塊炎癥的急性發(fā)作是導(dǎo)致斑塊易損、破裂、促進(jìn)急性冠脈綜合征發(fā)生的重要因素［3－4］。在研究中發(fā)現(xiàn)，易損斑塊內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其中以巨噬細(xì)胞數(shù)量增多明顯，因此，斑塊內(nèi)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)是易損斑塊的重要標(biāo)志［5－6］。單核細(xì)胞趨化因子－1(MCP－1)是趨化單核細(xì)胞的重要細(xì)胞因子，它促進(jìn)血液循環(huán)中的單核細(xì)胞向斑塊內(nèi)遷移而轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞［7－8］。巨噬細(xì)胞被激活并產(chǎn)生大量 MCP－1，促使更多的單核細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈壁，并吞噬脂蛋白形成泡沫細(xì)胞，參與粥樣斑塊的形成［9－10］。另外，激活的巨噬細(xì)胞還通過(guò)蛋白基質(zhì)降解酶，促進(jìn)基質(zhì)降解，導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定、破裂甚至血栓形成，導(dǎo)致病情急劇惡化，甚至危及生命［11－12］。針灸防治動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)缺血性疾病，臨床上已有較多應(yīng)用，療效顯著。研究發(fā)現(xiàn)，針灸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展有防治作用［13－14］。結(jié)合臨床應(yīng)用針刺治療冠心病獲得療效，本研究將從炎癥角度探討電針對(duì)AS的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

電針治療儀(G6805－Ⅱ型，青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司);全自動(dòng)生化儀(7080型，日立)。小鼠抗兔RAM11單克隆抗體(Dako Cytomation);抗小鼠二抗(美國(guó)vector公司);兔MCP－1ELISA試劑盒(美國(guó)R＆D公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型制備及治療

選用健康雄性日本純系大耳白兔27只，體重(2.0±0.2)kg，由北京華阜康動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和針灸組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對(duì)照組飼以普通料，不做任何處理;模型組、高脂飼料喂養(yǎng)2周，參照文獻(xiàn)［15］行股動(dòng)脈球囊拉傷術(shù)復(fù)制腹主動(dòng)脈易損斑塊模型，造模后繼續(xù)高脂飼養(yǎng)10周;針灸治療組:高脂飼養(yǎng)2周后行球囊拉傷術(shù)，造模后繼續(xù)高脂飼養(yǎng)8周，之后再給予2周的電針治療。

選穴:參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位選取［16］。簡(jiǎn)述如下:家兔仰臥于兔臺(tái)上四肢綁縛固定。局部常規(guī)消毒，足三里直刺1.5～2.5 cm，內(nèi)關(guān)穴直刺0.5～1 cm。針刺得氣后接通電針治療儀，輸出電路一組接左側(cè)足三里和內(nèi)關(guān)穴，一組接右側(cè)足三里和內(nèi)關(guān)穴。電針波形為疏密波，輸出電流強(qiáng)度以兔能耐受及局部肌肉微微抽動(dòng)為宜，每日 1次，每次20 min，持續(xù)14 天。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察

腹主動(dòng)脈標(biāo)本行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊的形態(tài)學(xué)改變。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

利用RAM11單克隆抗體行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，計(jì)數(shù)RAM11陽(yáng)性細(xì)胞。每組切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野數(shù)100個(gè)總細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占總細(xì)胞百分比。

1.5 血清MCP－1的檢測(cè)

采用ELISA法測(cè)定MCP－1含量。實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 病理學(xué)檢查結(jié)果

HE染色觀察，高倍鏡下可見:對(duì)照組主動(dòng)脈管壁薄厚均勻，內(nèi)膜完整，中膜、外膜分界清楚，無(wú)AS病灶。模型組，AS各期病變均可見，但以粥樣斑塊期多見，多表現(xiàn)為偏心斑塊，具有較大的脂質(zhì)核心薄的纖維帽，有豐富的泡沫細(xì)胞和明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，針灸組病變明顯減輕，見封三彩圖1。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

RAM11抗體標(biāo)記的巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)為胞漿內(nèi)棕黃色顆粒。模型組和針灸組均可見染成棕黃色的RAM11陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)，對(duì)照組胸主動(dòng)脈未檢測(cè)到RAM11的表達(dá)，針灸組RAM11陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)記的巨噬細(xì)胞與總細(xì)胞的比值降低，與模型組相比差異有顯著性，P＜0.05。見封三彩圖2和表1。

2.3 血清MCP－1表達(dá)結(jié)果

模型組血清MCP－1水平升高，與對(duì)照組相比，差異有顯著性，P＜0.01;電針可有效降低血清MCP－1水平，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)。見表2。

表1 電針對(duì)鼠抗兔巨噬細(xì)胞抗體11的影響(±s)

表1 電針對(duì)鼠抗兔巨噬細(xì)胞抗體11的影響(±s)

注:與模型組相比，*P ＜0.05。

組別 n MCP－1陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比(%)54.57 ±12.20針灸組 9 26.79 ±11.58模型組9*

表2 電針對(duì)血清MCP－1的影響(±s)

表2 電針對(duì)血清MCP－1的影響(±s)

注:與正常對(duì)照組相比，*P ＜0.01;與針灸組相比，※P ＜0.01。

組別 n MCP－1濃度(ng/L)正常對(duì)照組943.25 ±7.8022.85 ±6.41模型組 9 57.73 ±5.22＊※針灸組9

3 討論

中醫(yī)學(xué)把AS歸屬于“痰凝血瘀”范疇，其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)。治療采用化痰軟堅(jiān)行氣散結(jié)及活血化瘀之法。內(nèi)關(guān)穴為手厥陰心包經(jīng)，具有行氣活血之功;足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)，具有濁降、除痰濕之功。

針刺對(duì)AS斑塊發(fā)生發(fā)展有改善作用，可縮小斑塊的厚度和面積［13］。針刺內(nèi)關(guān)穴可以減少大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)的沉積及泡沫細(xì)胞的形成，同時(shí)降低致炎因子的表達(dá)［17］。由此推測(cè)，針刺通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MCP－1表達(dá)增高，與斑塊的穩(wěn)定密切相關(guān)［18］。

本研究結(jié)果提示，電針處理可以有效降低MCP－1的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，表明電針干預(yù)可有效預(yù)防AS的進(jìn)展，對(duì) AS有一定的治療作用，電針對(duì)MCP－1蛋白表達(dá)及巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)作用可能是防治AS機(jī)制之一。因此可以推測(cè)，電針對(duì)AS斑塊的防治效應(yīng)與抑制MCP－1和巨噬細(xì)胞循環(huán)通路有關(guān):電針通過(guò)抑制MCP－1表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞的入侵，進(jìn)而減少由巨噬細(xì)胞分泌的MCP－1和其它多種致炎因子以及蛋白基質(zhì)降解酶表達(dá)，降低斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)，抑制斑塊不穩(wěn)定性、斑塊內(nèi)出血和斑塊破裂的發(fā)生，達(dá)到降低急性缺血綜合征發(fā)生效應(yīng)。

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