黃 艷，王 璐，毛 鵬，牛國強(qiáng)，張薄博，許贛榮，*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122;2.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430056）

目前公認(rèn)的紅曲色素有6種，呈現(xiàn)橙、黃、紅三色。其中橙色的是紅曲玉紅素和紅斑紅曲素;黃色的是安卡紅曲黃素和紅曲素;紅色的是紅斑玉紅胺和紅斑紅曲胺。此外還有復(fù)合水溶性紅色素。

在食品著色劑方面，橙、黃色素是重要的食用色素品種。但目前國內(nèi)的天然橙、黃色素的研究和開發(fā)還處于起步階段，目前市場上是以采用化學(xué)還原法生產(chǎn)的半天然的紅曲黃色素［1］為主?；谑称钒踩珕栴}，化學(xué)合成色素逐漸被天然色素取代，因而天然色素呈現(xiàn)供不應(yīng)求的勢頭，其生產(chǎn)方法包括微生物發(fā)酵法和植物提取法［2］。植物來源的天然黃色素為提取法生產(chǎn)的梔子黃、姜黃、南瓜黃等［3］，這類色素的生產(chǎn)受季節(jié)影響大，成本高;微生物發(fā)酵法可大規(guī)模長年化生產(chǎn)，成本低。因此，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的天然紅曲橙、黃色素是繼紅曲紅色素之后很有市場潛力的色素［4］。

從技術(shù)上來講，微生物發(fā)酵法可利用突變的紅曲菌株，或通過微生物發(fā)酵條件的控制來達(dá)到主產(chǎn)某一類色素的目的。泰國 Yongsmith［5－7］等人通過誘變選育到了單產(chǎn)黃色素產(chǎn)生菌，但液態(tài)發(fā)酵黃色素色價(jià)不高，至今未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn);日本也研究開發(fā)紅曲黃色素并實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)［8］;在國內(nèi)，周波［9］等人通過誘變選育出了紅曲黃色素產(chǎn)生菌，但色價(jià)值僅達(dá)110U/mL。

紅曲菌生產(chǎn)色素，是一個(gè)復(fù)雜的代謝過程［10－11］，最先合成的色素是橙色素，再進(jìn)一步被還原成黃色素，或者轉(zhuǎn)化成紅色素。本研究從眾多紅曲菌中廣泛篩選菌落顏色偏黃的菌株，通過微生物發(fā)酵條件的控制，使紅曲菌不產(chǎn)紅色素而只產(chǎn)橙、黃色素。對紅曲發(fā)酵液中橙、黃色素的有關(guān)特性進(jìn)行了研究，主要研究內(nèi)容包括橙、黃色素提取液全波長掃描最大吸收峰及其所對應(yīng)的波長、色調(diào)、色價(jià)及其薄層層析分析。為紅曲黃、橙色素的生產(chǎn)開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅 曲 菌Monascussp.961，Monascussp.981，Monascussp.9085，Monascussp.FZ，Monascussp.W1，Monascussp.NEW，Monascussp.ZK－1，Monascussp.ZK－2，Monascussp.ZK－3，Monascussp.ZMI 均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

斜面PDA培養(yǎng)基（g/L）:馬鈴薯 200，葡萄糖20，瓊脂20，pH 自然。

種子培養(yǎng)基（g/L）:玉米淀粉40，玉米漿粉10，酵母膏 10，KH2PO42.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，初始pH為5。

搖瓶發(fā)酵基本培養(yǎng)基（g/L）:蔗糖60，玉米漿粉5.0，大豆粉 5.0，KH2PO42.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.03，NaNO35.0，初始 pH 為 5。

HY－G－a回旋式恒溫調(diào)速搖床柜 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;JLJ－001全波長自動掃描分光光度計(jì) 日立有限公司;PYX－XHS－405電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及發(fā)酵方法

1.2.1.1 種子培養(yǎng) 500mL三角瓶裝液量100mL，接種孢子懸浮液 10mL，28℃，140r/min，培養(yǎng) 30h。

1.2.1.2 搖瓶培養(yǎng) 500mL三角瓶裝液量50mL，接入種子液 5mL，32℃，170r/min，培養(yǎng) 6d。

1.2.2 菌種篩選 紅曲菌所產(chǎn)色素是紅色素、橙色素和黃色素所組成的復(fù)合色素，一般情況下，以紅色素為主。將實(shí)驗(yàn)室保藏的眾多紅曲菌接種到PDA斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，觀察比較菌落的顏色，篩選菌落顏色偏黃的菌株，對其分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法見1.1和1.2.1。

1.2.3 色價(jià)及色調(diào)測定 參考文獻(xiàn)［12－13］，將發(fā)酵液用研磨混勻后取1mL于50mL比色管中，用乙醇定容至50mL，顛倒混勻，置于55℃恒溫水浴中浸提40min。浸提結(jié)束后，取出冷卻至室溫，用乙醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)，并以乙醇為空白對照在200～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，測定OD值。

橙色價(jià)（U/mL）=OD值（465nm）×總稀釋倍數(shù)

黃色價(jià)（U/mL）=OD值（410nm）×總稀釋倍數(shù)

色調(diào)值=黃色價(jià)/橙色價(jià)

1.2.4 色素層析 參考文獻(xiàn)［14］，色素樣品:用甲醇從紅曲菌發(fā)酵液中粗提色素。

展開劑:甲苯/乙酸乙酯/甲酸:7/3/1

在層析缸內(nèi)倒入展開劑，平衡20min。用毛細(xì)管吸取上述色素樣品1mL，點(diǎn)滴在吹干后的層析板出發(fā)線上，將層析板放入層析缸內(nèi)，用壓板蓋實(shí)，開始進(jìn)行層析。當(dāng)溶劑前沿到達(dá)距層析板頂部3～5cm時(shí)，將層析板取出，觀察層析板上色素條帶，并計(jì)算Rf值。

Rf值=色素條帶距出發(fā)線的距離/溶劑前沿距出發(fā)線的距離

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)橙、黃色素紅曲菌株發(fā)酵性能比較

經(jīng)篩選獲得的10株紅曲菌發(fā)酵液掃描圖和色價(jià)測定結(jié)果如圖1和表1所示，實(shí)驗(yàn)方法見1.2.2和1.2.3

圖1 紅曲菌液態(tài)發(fā)酵色素提取液全波長掃描圖Fig.1 Absorption spectrum of Monascus pigments extracts by fermentation liquor

圖1是從表1中10株顏色偏黃紅曲菌中選取的5株有代表性的紅曲發(fā)酵色素提取液的全波長掃描圖。圖1a是產(chǎn)紅色調(diào)色素的紅曲發(fā)酵液全波長掃描圖，其特點(diǎn)是有二個(gè)吸收峰，分別為紅色素（505nm）和黃色素（410nm）吸收峰。一般沒有橙色素吸收峰（因橙色素一部分被轉(zhuǎn)化為紅色素，一部分轉(zhuǎn)化為黃色素）［10－11］。圖1中除 a之外的掃描圖譜結(jié)果表明，這些紅曲菌的發(fā)酵液中已經(jīng)沒有紅色素特征吸收峰（505nm），只有橙色素（465nm）和黃色素（410nm左右）特征吸收峰，說明初篩出的10株紅曲菌已不產(chǎn)紅色素，而只產(chǎn)黃色素和橙色素。

表1 紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素性能的比較Table 1 Comparision on the submerged fermentation of different Monascus spp.

表1為這10株紅曲菌發(fā)酵液色素性能的比較，色調(diào)值是黃色素色價(jià)與橙色素色價(jià)的比值，色調(diào)值越大，發(fā)酵液顏色越偏黃，反之則偏橙。如表1所示，Monascussp.NEW、Monascussp.961、Monascussp.ZK－1和Monascussp.9085的色調(diào)值較高，說明這四株菌主要產(chǎn)黃色素，而產(chǎn)橙色素較少。這四株菌中，Monascussp.961主產(chǎn)黃色素，僅在404nm處有唯一的吸收峰，其色價(jià)最高，高達(dá)200U/mL，高于已報(bào)道的其它研究結(jié)果［9，15－16］，是一株有潛力的紅曲黃色素生產(chǎn)菌。其余的六株菌主要產(chǎn)橙色素，其中Monascussp.W1產(chǎn)橙色素色價(jià)最高，可達(dá)436U/mL，也是一株有潛力的紅曲橙色素生產(chǎn)菌。

2.2 兩株高產(chǎn)色素紅曲菌發(fā)酵液色素的分離及解析

根據(jù)發(fā)酵液所呈現(xiàn)的色澤以及實(shí)驗(yàn)2.1的分析結(jié)果，確定Monascussp.961為天然黃色素高產(chǎn)菌，Monascussp.W1為天然橙色素高產(chǎn)菌。為了解發(fā)酵液中色素的種類及相對純度，采用薄層層析分析對這兩株紅曲菌發(fā)酵液色素提取液進(jìn)行分離及解析，結(jié)果見圖2。

Monascussp.961發(fā)酵液呈現(xiàn)誘人醒目的黃色;在普通光照下，尤其是熒光燈下，可看到的主要色素是黃色素，其次還有少量橙色素。此發(fā)酵液色素有6條色帶，其中最上部的Rf值為0.87和0.81的條帶，是黃色素和橙色素，但二者未分開，其余的均為黃色條帶（圖2左）。Monascussp.W1發(fā)酵液色澤呈現(xiàn)鮮艷奪目的橙色;在普通光照下（結(jié)合熒光燈下），可看到主要色素是橙色素，其次還有黃色素。其中Rf值為0.81的條帶為橙色素，其余5條為黃色色帶（圖2右）。結(jié)合發(fā)酵液顏色及板層析結(jié)果推斷，在一定發(fā)酵條件下，Monascussp.961可發(fā)酵生產(chǎn)黃色調(diào)為主的色素，而Monascussp.W1可發(fā)酵生產(chǎn)橙色調(diào)為主的色素。

圖2 Monascus sp.961和Monascus sp.W1色素板層析結(jié)果Fig.2 Separation of pigments by TLC of Monascus sp.961 and Monascus sp.W1

2.3 國內(nèi)外紅曲黃色素及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)指標(biāo)的比較和討論

從技術(shù)經(jīng)濟(jì)角度來考察微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紅曲橙、黃色素的可行性，有三個(gè)基本要求，首先要求所產(chǎn)生的色素是真正的天然色素，這才符合今后食品安全的大方向;其次是要求色素發(fā)酵液的色價(jià)高，這是工業(yè)化生產(chǎn)的基本要求;第三是所產(chǎn)的黃色素或橙色素應(yīng)符合其特征性，即在檢測時(shí)色素的最大吸收峰應(yīng)位于黃色素或橙色素的特征波長之下。表2列出了國內(nèi)外研究論文及市場上曾銷售過的紅曲黃色素的有關(guān)特征參數(shù)。

序號為4的水溶性紅曲黃其吸收峰在476nm處。這種色素是通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的半天然紅曲黃色素，其最大吸收峰在470～490nm之間，而從色調(diào)上分析，應(yīng)是以橙色為主。日本標(biāo)準(zhǔn)中，紅曲黃是以50%乙醇溶解后，在波長458～468nm范圍內(nèi)以最大吸收峰值計(jì)算色價(jià);韓國的紅曲黃標(biāo)準(zhǔn)中則提出最大吸收峰是在460nm處附近;Yongsmith等人［18］通過誘變選育的紅曲霉所產(chǎn)黃色素吸收峰在370nm處，但其也提到有的突變株所產(chǎn)生的紅曲黃色素有三個(gè)波峰，分別為500、420、370nm，這種色素可能是多種紅曲色素的混合物。因而可以得知，紅曲菌在一定發(fā)酵條件下可以產(chǎn)生不同色調(diào)的黃色素。

現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)純黃色素的微生物資源較少，序號為8、9、10的紅曲菌發(fā)酵液的最大吸收峰為370、410nm和404nm，這些菌株可認(rèn)為是以生產(chǎn)黃色素為主的紅曲菌;從色價(jià)上看，序號為10的紅曲菌株略勝一籌。而序號為11的紅曲菌發(fā)酵液橙色素（465nm）的色價(jià)達(dá)到436U/mL，已初步具有工業(yè)化生產(chǎn)的價(jià)值。

3 結(jié)論

首先，本文研究了紅曲發(fā)酵液中以橙、黃色調(diào)為主的色素的有關(guān)特性，根據(jù)色素提取液的全波長掃描圖譜中吸收峰所對應(yīng)的波長，可確定其主要色調(diào)為橙色和黃色。其次，對上述兩株菌所產(chǎn)色素提取液進(jìn)行了硅膠薄層層析研究，根據(jù)呈現(xiàn)的色素條帶，進(jìn)一步明確了其所產(chǎn)色素的類型為橙色或黃色;最后，對國內(nèi)外黃色素產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中的特征參數(shù)以及部分黃色素產(chǎn)品的相關(guān)參數(shù)，以及國內(nèi)外天然色素和市場的半天然色素的吸收峰進(jìn)行了比較分析，確定了本實(shí)驗(yàn)篩選菌株所產(chǎn)色素的最大吸收峰符合天然黃、橙色素的吸收峰范圍。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，挑選出了高產(chǎn)黃色素（Monascussp.961）和高產(chǎn)橙色素（Monascussp.W1）的紅曲菌株，色價(jià)分別為200U/mL和436U/mL，且其液態(tài)發(fā)酵液色素的色價(jià)相對較高，可望運(yùn)用于規(guī)模化生產(chǎn)。

表2 國內(nèi)外紅曲橙、黃色素的比較Table 2 The comparision of Monascus orange/yellow pigments in domestic and overseas

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