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(1. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047; 2. 南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047; 3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院,江西南昌 330004; 4. 溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江溫州 325035)

蛋白質(zhì)是一類重要的生物分子,其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是建立蛋白質(zhì)量值溯源傳遞體系,實現(xiàn)蛋白質(zhì)計量的重要器具。研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)可作為健康或疾病的標(biāo)志物,常用于商業(yè)分析[1 - 2]。例如,測量的蛋白質(zhì)血清心肌肌鈣蛋白I已成為心肌梗死(心臟病發(fā)作)的臨床診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”。這些測量的準(zhǔn)確度是否可靠是臨床診斷的依據(jù),不同的臨床實驗制造商采用不同的校準(zhǔn)器和不同的特異性抗體,因此這些商業(yè)分析系統(tǒng)給出的結(jié)果,可比性較差。只有按標(biāo)準(zhǔn)測量程序參照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量的結(jié)果,才能使臨床檢測和診斷實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。

食物的成分準(zhǔn)確分析,也有賴于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用。以過敏原蛋白為例,食物過敏研究的數(shù)據(jù)顯示,制備過敏原蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于安全檢測是非常必要的[3]。若未采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),不同的檢測結(jié)果可能有數(shù)倍以至幾十倍的差異[4 - 5],結(jié)論難以令人信服。為了實現(xiàn)實驗結(jié)果的可比性、準(zhǔn)確性和可溯源性[6],標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用是必須條件。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在臨床醫(yī)學(xué)和食品衛(wèi)生領(lǐng)域有著重要地位,包括用于腫瘤細(xì)胞的檢測[7]、糖尿病診斷[8]、藥物篩選、抗體檢測[9]、轉(zhuǎn)基因食品、食物過敏[10]和食品添加劑的檢測等。隨著蛋白質(zhì)疾病、腫瘤標(biāo)志物在臨床檢驗中的應(yīng)用,蛋白質(zhì)功能食品的興起,以及對食物過敏等食品安全問題的重視,市場將有更多的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需求。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是蛋白質(zhì)檢測,尤其是定量分析中使用的實物標(biāo)準(zhǔn)。作為計量學(xué)上的計量器具之一,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一直是國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)化組織研究的重要內(nèi)容,其制備和使用直接影響到蛋白質(zhì)檢測數(shù)據(jù)的可靠性和有效性。但因受到實驗室技術(shù)裝備、蛋白質(zhì)自身性質(zhì)和計量溯源性等條件的制約,蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)難以標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),現(xiàn)有蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的種類相對較少。未來蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備應(yīng)結(jié)合蛋白質(zhì)計量的需求以及蛋白質(zhì)計量技術(shù)的發(fā)展方向,提高蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量,增加供應(yīng)種類[11]。

1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

1. 1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Reference Material)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有一種或多種足夠均勻和良好確定特性,用以校準(zhǔn)測量設(shè)備、評價測量方法或給材料賦值的一種材料或物質(zhì)[12 - 13]。定義中的“特性”是包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的化學(xué)成分、物理性質(zhì)、工程參數(shù)等[14 - 15]。

1. 2 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Certified Reference Material)

有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是附有認(rèn)定證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),其一種或多種特性量值用建立了溯源性的程序確定,使之可溯源到準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)的表示該特性值的測量單位。每一種認(rèn)定的特性量值都附有給定置信水平的不確定度。

2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備與表征

2. 1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和質(zhì)量控制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和表征應(yīng)按照ISO導(dǎo)則[16 - 18]、2000年版《中國生物制品規(guī)程》和《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》[19]的要求進行制備。制備蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),首先蛋白質(zhì)純化所采用的方法應(yīng)是常規(guī)、簡單和公認(rèn)的。純化蛋白質(zhì)的一般步驟為:蛋白質(zhì)的粗提取,對目標(biāo)蛋白質(zhì)進行分餾、濃縮和穩(wěn)定化,去雜質(zhì),后期純化[20 - 21]。理想的蛋白質(zhì)分離提純方法,需要在保持蛋白質(zhì)生物活性的前提下,達(dá)到蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度要求。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)初步檢查主要包括:外觀初步檢查,蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是固體粉末狀顆粒,也可以是溶液狀態(tài)；理化特性表征,包括吸水性、pH等；另外還需對蛋白質(zhì)進行無菌檢查、純度及雜質(zhì)檢查。檢查結(jié)果符合各方面的要求后,方能進行分裝和包裝。

2. 2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征及常用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫

國際物質(zhì)量咨詢委員會(CCQM)于2001年確定的蛋白質(zhì)計量研究內(nèi)容包括蛋白質(zhì)定量、相對分子質(zhì)量、蛋白質(zhì)功能、生物學(xué)活性[22]以及蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)等[23]。蛋白質(zhì)鑒定的第一步往往就是測定其分子量,分子量的正確與否預(yù)示著該多肽或蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是否正確。質(zhì)譜技術(shù)(Mass Spectrometry,MS)[24]為快速準(zhǔn)確地獲取蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)信息提供了權(quán)威的檢測技術(shù)手段。圓二色光譜(CD)可以用來定量估計蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)下的各種二級結(jié)構(gòu)(如α - 螺旋,β - 折疊,β - 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲)。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征離不開蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,常用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫有:PDB、ISSD、HSSP、SCOP等。

蛋白質(zhì)的基本立體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫為PDB(Protein Data Bank),1971年建立于美國布魯?？撕Ｎ膰覍嶒炇摇Ｔ摂?shù)據(jù)庫中收集了通過X射線衍射和核磁共振(NMR)實驗測定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的精確坐標(biāo)數(shù)據(jù)。這種數(shù)據(jù)即蛋白質(zhì)中的原子坐標(biāo)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的最細(xì)致的層次。該數(shù)據(jù)庫的管理者是結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)合作研究組織(Research Collaboration for Structural Bioinformatics,RCSB)。

ISSD蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,其每個條目包含一個基因的編碼序列,同相應(yīng)的氨基酸序列對比,并給出相應(yīng)多肽鏈的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。核苷酸序列取自GenBank,結(jié)構(gòu)參數(shù)來自PDB,包括多肽骨架原子坐標(biāo),二面角,還有DSSP程序所預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)。

HSSP是根據(jù)同源性導(dǎo)出的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。每一條PDB項目都有一個對應(yīng)的HSSP文件。該數(shù)據(jù)庫同時提供了SWISS - PROT數(shù)據(jù)庫中所有蛋白質(zhì)序列的同源性。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫(structural classification of proteins,SCOP)是對已知的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行手動分類得到的數(shù)據(jù)庫,將已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)進行有層次地分類。該資源允許用戶分析查詢蛋白質(zhì)是否和已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)具有相似性。

2. 3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的延續(xù)性

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的延續(xù)性是指標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在一定范圍內(nèi),能夠在不同時間、空間用于檢測分析和統(tǒng)一量值。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種消耗性物質(zhì),因此必須保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備是可以延續(xù)的,即標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)必須有足夠的批量,且能夠迅速地再生產(chǎn)獲得。

2. 4 新技術(shù)的應(yīng)用

一般而言,蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的主要影響因素包括二硫鍵、氫鍵和鹽橋等,而這往往也是提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的著力點。提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,可考慮降低折疊與非折疊的熵差,減少非折疊的構(gòu)象,還可通過穩(wěn)定α螺旋和填充疏水內(nèi)核,使蛋白質(zhì)構(gòu)象處于能量最低狀態(tài)和最穩(wěn)定狀態(tài)[25]。蛋白質(zhì)工程技術(shù)[26]通過對蛋白質(zhì)進行修飾,改造和拼接以生產(chǎn)出能滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備要求的蛋白質(zhì)。另外,通過基因工程菌的重組和表達(dá)[27],可擴大蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備規(guī)模,滿足蛋白質(zhì)檢測分析的計量需求。

3 均勻性檢驗和穩(wěn)定性評價

3. 1 均勻性檢驗

均勻性檢驗按照《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》[19]的要求,確定抽樣方法、抽取單元數(shù)和最小取樣量[28],測量取自不同包裝單元(如:瓶、包等)或同一包裝單元以及特定大小的樣品。影響蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性的因素有:純度、分裝精度及其自身的化學(xué)形態(tài)和結(jié)構(gòu)狀況,并保證均勻性檢驗實驗條件的一致性。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析按照ISO導(dǎo)則35(2006版)[18]的要求,檢查蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測結(jié)果。通過均勻性檢驗結(jié)果,一方面說明特性值在各個部位之間是否均勻；另一方面要測定標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值在不同部位之間不均勻的程度,即確定不確定度,并說明可能的變化來源,進而判斷不均勻性程度是否可以接受。若測量結(jié)果落在規(guī)定不確定度范圍內(nèi),則可認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所指定的特性是均勻的[29],為考查蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性做好準(zhǔn)備。

3. 2 穩(wěn)定性評價

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性,是指在規(guī)定的儲存和使用條件下,在規(guī)定的時間間隔內(nèi),其特性量值在規(guī)定的范圍內(nèi)保持不變的能力,是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本性質(zhì)之一。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性考察及評價應(yīng)真實地反映出該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性能,使標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能在有效期內(nèi)發(fā)揮其量值傳遞的作用。

3. 2. 1 穩(wěn)定性評價的方法 穩(wěn)定性的檢測有影響因素實驗、加速實驗[22]和長期實驗。穩(wěn)定性檢驗的測試方法應(yīng)是精密和靈敏的,并且具有很好的重現(xiàn)性。對于新研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),隨機取一最小單元,從新研制完成開始,測定其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值隨時間變化的情況,此最小單元在考察的時間間隔按此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的存放條件保存,以確保穩(wěn)定性實驗的有效性和準(zhǔn)確性。評價標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性有t檢驗法和平均值一致性檢驗法[30],以統(tǒng)計分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值是否發(fā)生顯著性變化。

3. 2. 2 影響蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的因素 影響穩(wěn)定性的因素主要有:光、溫度和濕度等物理因素；溶解、分解和化合等化學(xué)因素及細(xì)菌作用等生物因素。由于蛋白質(zhì)不穩(wěn)定,容易降解,可能需要避光低溫貯藏。此外,殘留水分含量也有可能影響標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性[31]?？疾旆治龅鞍踪|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在環(huán)境因素影響下的變化規(guī)律,可以為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生產(chǎn)、包裝、貯藏、運輸條件提供科學(xué)依據(jù)[32 - 33]。

4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及不確定度的評定

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值是采用技術(shù)上正確的方法進行測定,確定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值,并由測定不確定度組成。

4. 1 定值方式

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的測定有幾種技術(shù)上有效的方式。按定值內(nèi)容來選擇測量方法及具體測量方案(即采用單個實驗室、一種權(quán)威的測量方法或是采用多個實驗室合作研究)[34]。具體選擇哪一種方法應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的類型、最終使用需求、實驗室所具備的資質(zhì)和所用方法的質(zhì)量水平來評估特性值的不確定度。WHO生物制品標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會通常采用國際間實驗室聯(lián)合定值的方法[35 - 36]。

根據(jù)《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》和ISO導(dǎo)則35,定值分析要求每個實驗室至少提供一個最小單元(瓶)特性量值的測定結(jié)果,每瓶樣品至少提供2個以上特性值的重復(fù)測量數(shù)據(jù),測量數(shù)據(jù)都保留4位有效數(shù)字。定值分析所使用的樣品瓶號是隨機抽取的。

4. 2 定值范圍

準(zhǔn)確檢測蛋白含量是實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源傳遞的基礎(chǔ),其測定按照2005年版中國藥典三部方法進行[37]。對于純蛋白質(zhì),常規(guī)的蛋白質(zhì)含量測定方法包括氨基酸分析、定氮法以及純度扣除法等,目前國際公認(rèn)的權(quán)威方法包括精密庫侖法、同位素稀釋質(zhì)譜法、重量法、容量法、凝固點下降法等[38]。此外,免疫技術(shù)也應(yīng)用于蛋白質(zhì)的定性和定量[39]。

4. 3 與國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比較

研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的譜圖相同,國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)稀釋后,兩者的譜圖幾乎重合,說明兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所含的物質(zhì)相同；用本研究的定值方法對國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行測定,定值結(jié)果與國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值相對比無顯著差異,則說明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方法準(zhǔn)確、可靠。

4. 4 定值結(jié)果的統(tǒng)計處理

蛋白質(zhì)檢測結(jié)果不確定度的評定依照J(rèn)JF1059 - 1999《測量不確定度評定與表示》[40]。定值數(shù)據(jù)分析首先經(jīng)Dixon檢驗、Gmbbs檢驗判斷有無離群值,經(jīng)相應(yīng)處理后,并根據(jù)不確定度公式計算出定值的不確定度[41]。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值具有準(zhǔn)確計量的或嚴(yán)格定義的認(rèn)定值,認(rèn)定值與真值的偏離程度不超過計量方法的不確定度。當(dāng)用計量方法確定認(rèn)定值時,認(rèn)定值就是被測定特性量值之真值的最佳估計值,認(rèn)定值與真值的偏離程度不超過計量方法的不確定度。

通常標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書中都要給出認(rèn)定值及其不確定度。認(rèn)定值總不確定度的分析(即定值分析數(shù)據(jù)平均值的平均值)的總不確定度來源由3部分組成:一是通過測量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測量次數(shù)及所要求的置信概率按統(tǒng)計方法計算得出,并對測量的其它一些影響因素作出分析估算出其大?。欢俏镔|(zhì)的均勻性引起的不確定度的估計；三是物質(zhì)在有效期內(nèi)穩(wěn)定性發(fā)生變動引起的不確定度分量。

4. 5 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度的評定

根據(jù)ISO導(dǎo)則35,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的不確定度評定[42]主要包括四個部分:方法定值的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)瓶間不均勻性產(chǎn)生的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的長期穩(wěn)定性所引起的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的短期穩(wěn)定性所引起的不確定度。

利用ISO導(dǎo)則35所給出的公式計算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度,將標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子,計算得到定值結(jié)果的擴展不確定度,根據(jù)其與真值的接近程度判斷是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測量需求。

5 結(jié)語

國內(nèi)外眾多標(biāo)準(zhǔn)化組織及計量科學(xué)工作者正致力于蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究,并把蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為計量工具的完善和補充。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備,需要建立起系統(tǒng)的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備流程及方法,嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)量控制,采用權(quán)威方法聯(lián)合多家實驗室定值。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可應(yīng)用于臨床檢驗、生物醫(yī)藥、食品安全等領(lǐng)域,為蛋白質(zhì)的分析檢測提供可靠的量值溯源保證,應(yīng)用前景十分廣闊。

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