張?jiān)迫悖惾A清，高艷輝，邢志林，趙天濤

1重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054 2重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054

可降解TCE的甲烷氧化菌16S rDNA與pmoCAB基因簇序列分析

張?jiān)迫?，陳華清1，高艷輝2，邢志林2，趙天濤2

1重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054 2重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054

張張張, 陳華清, 高艷輝, 等. 可可可TCE的的的的的的16S rDNA與pmoCAB基基基基基基基. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(12): 1900–1911.

Zhang YR, Chen HQ, Gao YH, et al. Sequence analysis of 16S rDNA and pmoCAB gene cluster of trichloroethylene-degrading methanotroph. Chin J Biotech, 2014, 30(12): 1900–1911.

甲烷氧化菌可高效催化甲烷和多種氯代烴降解，開展甲烷單加氧酶的基因簇序列分析研究有助于深入了解催化機(jī)理，并提升其在污染物生物降解領(lǐng)域中的應(yīng)用價(jià)值。以甲烷為唯一碳源富集分離甲烷氧化菌，取5種氯代烴作為共代謝基質(zhì)考察其降解情況，利用MEGE5.05軟件構(gòu)建基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹對所選菌株進(jìn)行初步鑒定，用半巢式PCR法分段擴(kuò)增菌株的顆粒性甲烷單加氧酶 (pMMO) 基因簇并進(jìn)行T-A克隆測序，通過ExPASy計(jì)算pMMO三個(gè)亞基的理論分子量。篩選到了一株甲基孢囊菌Methylocystis sp. JTC3，在三氯乙烯 (TCE) 初始濃度為15.64 μmol/L條件下，反應(yīng)5 d后降解率可達(dá)93.79%。經(jīng)擴(kuò)增、測序、拼接得到了3 227 bp的pmoCAB基因簇序列，包括771 bp的pmoC基因、759 bp的pmoA基因、1 260 bp的pmoB基因和2個(gè)非編碼中間序列，所對應(yīng)γ、β、α亞基理論分子量分別為29.1 kDa、28.6 kDa和45.6 kDa。通過Blast比對發(fā)現(xiàn)Methylocystis sp. JTC3的pmoCAB基因簇序列與Methylocystis sp. strain M的pmoCAB一致性較高，其中pmoA的序列相對保守。JTC3菌株可高效降解TCE，對pmoCAB基因簇序列的詳細(xì)分析可為pMMO活性中心特征、氯代烴類底物選擇性等方面的深入研究提供信息數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

甲烷氧化菌，三氯乙烯，pmoCAB基因簇，16S rDNA，系統(tǒng)發(fā)育樹

氯代烴類化合物具有很強(qiáng)的致癌作用，由于在工業(yè)上的廣泛使用，氯代烴類化合物造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，三氯乙烯(Trichloroethylene，簡稱TCE) 是這類化合物中的典型污染物[1-2]。甲烷氧化菌不僅能夠利用甲烷作為碳源和能源生長[3-4]，而且這些微生物還可以氧化包括TCE在內(nèi)的多種氯代烴，甲烷單加氧酶 (Methane monooxygenase，MMO) 在降解過程起著關(guān)鍵作用，在工業(yè)污染治理領(lǐng)域顯現(xiàn)出了潛在的價(jià)值[5-6]。甲烷氧化菌能夠產(chǎn)生兩種類型的MMO：溶解甲烷單加氧酶 (Solution methane monooxygenase，sMMO) 和顆粒甲烷單加氧酶 (Particulate methane monooxygenase，pMMO)[7-8]，由于兩種酶在底物范圍、底物親和性和對抑制劑敏感程度等方面的差異性，導(dǎo)致不同菌株催化降解氯代烴范圍和效率的不同。sMMO和pMMO在微生物體內(nèi)具有相似功能，但兩者的基因序列、晶體結(jié)構(gòu)和底物選擇性等都存在顯著差異[9-11]。近年來研究人員對基于發(fā)孢甲基彎菌Methylosinus trichosporium OB3b、莢膜甲基球菌Methylococcus capsulatus Bath兩株甲烷氧化菌的sMMO有較深入研究[12-13]，sMMO由羥基化酶 (MMOH)、還原酶(MMOR)、調(diào)節(jié)蛋白 (MMOB) 以及未知功能的orfY四部分組成。國內(nèi)外對pMMO的研究主要集中在晶體結(jié)構(gòu)、底物對基因表達(dá)影響、基因工程菌構(gòu)建等[14-16]。pMMO由α、β和γ亞基以1∶1∶1的比例組成，以 (αβγ)3三聚體形式存在；編碼pMMO的基因簇pmmo由3個(gè)功能基因組成，按pmoCAB排列，分別編碼γ亞基、β亞基、α亞基。Basu等[17]從Methylococcus capsulatus Bath中分離純化得到pMMO的α (47 kDa)、β (27 kDa)、γ (23 kDa) 亞基和一個(gè)63 kDa的蛋白質(zhì)推測為還原酶 (pMMOR)，并明確指出該3個(gè)亞基組成的蛋白為羥基化酶(pMMOH)，對于pMMO酶系類似于sMMO的MMOR、MMOB功能的蛋白目前還沒有成功分離純化。當(dāng)前所有對pMMO的晶體結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)分析都是基于 (αβγ)3三聚體[18]，對各亞基在催化甲烷氧化及氯代烴降解過程中的作用認(rèn)識(shí)非常有限[12]。

多數(shù)甲烷氧化菌僅以甲烷為唯一碳源和能源，這對純菌株的獲取、傳代和保藏有諸多不便，且pMMO以顆粒形式結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜上，因此從純菌株的細(xì)胞膜雙層脂疏水環(huán)境中對pMMO分離純化和生化表征存在困難[13,19]。分子生物學(xué)的快速發(fā)展使基因測序和分析成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要方法[20]，結(jié)合計(jì)算化學(xué)方法和譜學(xué)表征信息，可以預(yù)測蛋白質(zhì)的某些生化參數(shù)、修飾蛋白質(zhì)的某些功能，提供闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要信息，這些都以GenBank中有大量的基因信息為前提。但GenBank數(shù)據(jù)庫中pmoCAB基因信息并不完善，目前只有9株7個(gè)屬的甲烷氧化菌全基因組 (包含pmoCAB) 序列信息，5株甲烷氧化菌的pmoCAB序列在GenBank中單獨(dú)注冊，這阻礙了對MMO結(jié)構(gòu)和催化功能的深入研究，一定程度上限制了甲烷氧化菌在溫室氣體減排和污染物降解領(lǐng)域的應(yīng)用。目前國內(nèi)還沒有關(guān)于pmoCAB序列擴(kuò)增的報(bào)道。

據(jù)此，本研究分離得到一株可降解TCE的甲烷氧化菌JTC3，研究了其對TCE的耐受性和共代謝降解能力；考察了16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析；分析了代謝過程中關(guān)鍵酶pmoCAB基因結(jié)構(gòu)。該研究對甲烷氧化菌關(guān)鍵酶結(jié)構(gòu)的深入研究及其在污染物降解領(lǐng)域的應(yīng)用提供了有價(jià)值的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

NMS液體培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[21]配制。文中涉及的擴(kuò)增引物見表1，由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。礦化垃圾取自上海老港生活垃圾填埋場，填埋時(shí)間18 a，含水分13.2%，總氮0.47%，有機(jī)質(zhì)9.96%，pH值7.73。研究用LA Taq酶、DL 2 000 bp DNA marker和500 bp DNA ladder (Dye plus) 購自寶生物工程 (大連) 有限公司。主要設(shè)備有：Eppendorf 5332型PCR儀、BIORAD凝膠成像儀、SC-6 000A氣相色譜儀(配ECD檢測器)。

1.2 方法

1.2.1 甲烷氧化菌的分離純化

選取4 mm篩下和2 mm篩上礦化垃圾顆粒100 g，置于500 mL血清瓶后具塞密封，用100 mL甲烷置換瓶中空氣，30 ℃密閉馴化2周實(shí)現(xiàn)甲烷氧化菌的富集復(fù)壯。對富含甲烷氧化菌的礦化垃圾進(jìn)行10倍系列稀釋，以甲烷為碳源用NMS固體平板分離純化，連續(xù)純化4?5代得到單菌落。

表1 引物及其核苷酸序列Table 1 Primers and their nucleotide sequences

1.2.2 基因組提取、DNA產(chǎn)物純化及T-A克隆

基因組提取參照TIANGEN DP302細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明；PCR產(chǎn)物純化參照TIANGEN DP209瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒；T-A克隆參照寶生物pMD?19-T Vector Cloning Kit試劑盒說明。

1.2.3 JTC3菌株降解氯代烴試驗(yàn)

取甲烷氧化菌JTC3種子液1 mL注入分裝了20 mL NMS培養(yǎng)基的100 mL血清瓶中，用20 mL甲烷置換瓶中等量空氣置于30 ℃、170 r/min恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)2?3 d作為生物介質(zhì)。以潔凈空氣置換血清瓶中氣體，再用20 mL甲烷置換瓶中空氣，配制不同的氯代烴飽和溶液并取1 mL至菌液中使其達(dá)到特定的初始濃度。定時(shí)頂空取樣，利用氣相色譜儀檢測氯代烴的濃度變化，由亨利定律可換算得到氯代烴的液相濃度[24]，比較菌株JTC3對不同氯代烴的共代謝降解情況。

以同樣方法富集菌液，將配制好一定濃度梯度的TCE飽和溶液加入系列處理后的血清瓶中，每組設(shè)置3個(gè)平行樣，同時(shí)設(shè)置無菌對照組。此時(shí)血清瓶中含有甲烷和不同濃度TCE (0?70 μmol/L)。每隔一定時(shí)間氣相色譜檢測瓶中甲烷濃度變化，直至甲烷消耗完；同時(shí)檢測TCE的濃度變化，觀察TCE對甲烷氧化的影響及不同濃度TCE的降解情況。

1.2.4 氣相色譜檢測條件

氯代烴檢測，色譜柱：GDX-104 2 m；氮?dú)鉃檩d氣，載氣流速：35 mL/min；尾吹氣速：10 mL/min；進(jìn)樣器(汽化室) 溫度：120 ℃；柱箱溫度 (柱溫)：90 ℃；檢測器溫度：200 ℃；進(jìn)樣量：0.1 mL；基流補(bǔ)償0.00 nA。

生物氣檢測 (甲烷、氧氣和二氧化碳)：TCD檢測器；色譜柱：TCX-01 1 m；氮?dú)鉃檩d氣，載氣流速：40 mL/min；進(jìn)樣器 (汽化室) 溫度：120 ℃；柱箱溫度 (柱溫)：90 ℃；檢測器溫度：120 ℃。

1.2.5 JTC3菌株的16S rDNA序列分析及分類鑒定

以甲烷氧化菌株JTC3的基因組DNA為模板，用引物F27/R1429擴(kuò)增其16S rDNA并測序，選擇具有代表性的16S rDNA序列相對完整的甲烷氧化菌，用MEGA 5.05軟件中的鄰近法(NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合NCBI (National center for biotechnology information)的Blast (Basic local alignment search tool) 分析對菌株JTC3進(jìn)行分類鑒定。PCR反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃ 35 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min 。

1.2.6 JTC3菌株的pmoCAB基因簇的分段擴(kuò)增和序列分析

以JTC3菌的基因組為模板，通過簡并引物A189gc/Mb661擴(kuò)增其pmoA基因片段并測序，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 1 min，59 ℃45 s，68 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 5 min。

根據(jù)GenBank中pmoCAB基因簇同源序列信息和已測得的JTC3的部分pmoA基因序列，用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出6對嵌套引物 (圖1，表1)，采用三輪半巢式PCR分別擴(kuò)增pmoB和pmoC基因片段并進(jìn)行T-A克隆測序，與已知的pmoA基因序列拼接成pmoCAB基因簇，用菌落PCR法[25]鑒定陽性克隆子。每輪半巢式PCR的模板及引物見表2，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 35 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min 。

圖1 pmoCAB基因簇構(gòu)成及引物設(shè)計(jì)位置示意圖Fig. 1 Constitute map of pmoCAB gene clusters and location of primer designed where the black and gray regions are primer sites and noncoding regions respectively. The digital sites of 1 to 8 are PU 5′, PU 3′-1, PU 3′-2, PU 3′-3, PD 5′-1, PD 5′-2, PD 5′-3, PD 3′ respectively.

表2 pmoC和pmoB基因片段三輪半巢式PCR所用引物及模板Table 2 Primers and templates used in semi-nested PCR

用Blast分析JTC3菌的pmoCAB基因簇序列及各組分的核苷酸序列，并用DNAMAN 6.0.3.99軟件翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，比較同源性相近甲烷氧化菌MMO間的組成差異。

根據(jù)pmoCAB各組分對應(yīng)的氨基酸序列，利用ExPASy服務(wù)器中Compute pI/Mw工具計(jì)算pMMO中各組分的理論等電點(diǎn)和分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲烷氧化菌的分離純化

分離得到一株甲烷氧化菌菌株，命名為JTC3，在甲烷為唯一碳源的NMS平板能快速生長。該菌株菌落特征：透明圓形，菌落直徑1?1.5 mm，表面光滑微隆起，濕潤，與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密易挑取，周圍平整。光學(xué)顯微鏡革蘭氏染色呈陰性，球菌，菌體直徑約為0.5 μm，無鞭毛，無芽胞。

2.2 甲烷氧化菌JTC3降解氯代烴

利用甲烷氧化菌JTC3對1,2-二氯乙烷、1,2-二氯丙烷、TCE等5種氯代烴進(jìn)行降解研究，5 d后氯代烴的降解效果如圖2所示。由圖2A可見，除TCE外，其他4種氯代烴基本無變化，這與Oldenhuis等[26]得出的TCE為易降解化合物并且甲烷氧化菌與不同氯代烴親和性不同的結(jié)論相一致，TCE 5 d的降解量為0.29 μmol/L；圖2B為5 d 后的TCE濃度變化，5 d對照組濃度基本無變化，實(shí)驗(yàn)組由初始(15.64±0.27) μmol/L降為(0.97±0.041) μmol/L，平均降解率為93.79%，其降解速率隨濃度的減小逐漸降低，而對照組濃度5 d后基本無變化。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)TCE濃度在0.20?250.38 μmol/L范圍內(nèi)，最大氧化速率Vmax變化達(dá)120倍[27]，說明氯代烴初始濃度對甲烷氧化菌的降解活性影響顯著。Methylocystissp. M在TCE初始濃度為7.6 μmol/L (原文為1 ppm) 時(shí)，6 d后才開始降解TCE，第7天時(shí)TCE降解率約為91%[28]。與甲基孢囊菌Methylocystis sp. M比較，JTC3菌株能耐受高濃度的TCE，且降解TCE效率更好。

Oldenhuis等[26]詳細(xì)研究了TCE對細(xì)胞毒性作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的失活程度與TCE的降解量成正比。Choi等[29]研究了TCE對混合菌群甲烷氧化及pmoA基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著TCE濃度的增加，pmoA的基因拷貝數(shù)逐漸減小。在考察TCE脅迫條件下JTC3菌株的甲烷氧化能力時(shí)，發(fā)現(xiàn)了不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖3所示，當(dāng)TCE濃度較低時(shí) (12.55?20.76 μmol/L)，JTC3菌株的甲烷氧化能力不但沒有被抑制，反而有所促進(jìn)。但當(dāng)TCE濃度超過60.76 μmol/L時(shí)甲烷氧化速率較低，在20 h以后甲烷基本不再被氧化，可以推測TCE影響甲烷單加氧酶的活性進(jìn)而影響甲烷的氧化。為了進(jìn)一步探究甲烷氧化菌JTC3的代謝特性，還需對其進(jìn)行初步分類鑒定以及pMMO基因簇的序列分析。

圖2 甲烷氧化菌JTC3降解5種氯代烴效果及TCE濃度變化Fig. 2 Degradation of chlorinated hydrocarbons (A) by Methylocystis sp. JTC3 and variation of TCE concentration over time (B).

圖3 不同TCE濃度對甲烷氧化的影響Fig. 3 Effect of TCE concentration on methane oxidation.

2.3 甲烷氧化菌JTC3菌株的16S rDNA序列分析及其分類鑒定

通過PCR擴(kuò)增得到1 500 bp左右的特異性16S rDNA條帶 (圖4)，測序?yàn)? 487 bp；構(gòu)建了基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖5)，菌株有三大分支，一是包括5株甲基孢囊菌和4株甲基彎菌的α變形菌綱分支；中間是包括6個(gè)菌株的γ變形菌綱分支；最下面一支是外群生絲微菌屬的一個(gè)菌株。一般當(dāng)一個(gè)分支上置信度大于95%時(shí)，該分支內(nèi)的兩個(gè)菌株為同一種，菌株JTC3屬于α變形菌綱分支，與Methylocystis sp. M以99%的置信度聚為一支。

經(jīng)NCBI網(wǎng)站的Blast分析，JTC3菌株的16S rDNA序列中，有92%的堿基與甲基孢囊菌屬的EB-1、IMET 10484、WI 14M等菌株一致性達(dá)到99%，95%的16S rDNA序列與Methylocystis sp. M一致性達(dá)98%。綜上系統(tǒng)發(fā)育樹分析和Blast比對結(jié)果及其代謝特征，甲烷氧化菌JTC3為α變形菌綱/根瘤菌目/甲基孢囊菌屬一個(gè)種，命名為Methylocystis sp. JTC3。

圖4 甲烷氧化菌JTC3的16S rDNAFig. 4 PCR products electrophoresis of 16S rDNA from Methylocystis sp. JTC3. 1?4: 16S rDNA of Methylocystis sp. JTC3.

圖5 基于16S rDNA的Methylocystis sp. JTC3系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic analysis of the 16S rDNA from Methylocystis sp. JTC3.

2.4 JTC3菌株的pmoCAB基因簇分段擴(kuò)增及序列分析

菌株JTC3的pmoCAB基因簇中部pmoA基因片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖6A，在500 bp附近有一條特異性的DNA條帶，經(jīng)純化測序?yàn)?89 bp，與GenBank中甲烷氧化菌的pmoA(AM849782.1) 序列一致性達(dá)到99%，表明該特異性片段為pmoA的基因片段。

在此基礎(chǔ)上用三輪半巢式PCR擴(kuò)增菌株JTC3的pmoC端和pmoB端基因片段，結(jié)果見圖6B。根據(jù)GenBank中pmoCAB同源基因序列信息可以預(yù)測JTC3的pmoCAB基因簇、pmoC片段及pmoB片段的序列長度范圍，用以分析PCR結(jié)果。圖6B顯示pmoC端片段在1 000 bp?1 500 bp處有單一DNA條帶 (預(yù)測值約1 340 bp)，pmoB端片段在1 500 bp附近有單一DNA條帶 (預(yù)測值約1 570 bp)，均與預(yù)測的序列長度相符，且無非特異性條帶，表明經(jīng)過三輪半巢式PCR成功擴(kuò)增出pmoC端和pmoB端片段基因。

2.5 pmoCAB基因簇序列分析

將測序所得的pmoC片段和pomB片段基因序列與已測得的pmoA序列拼接，得到pmoCAB基因簇全序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中登記，登記號(hào)為pmoCAB KJ499432、pmoA KF742674、pmoB KF742675、pmoC KF742673。分析得知pmoCAB基因簇共3 226 bp，其中第1?771 bp間片段為pmoC基因，第1 087?1 845 bp間759 bp片段為pmoA基因，第1 967?3 226 bp間1 260 bp片段為pmoB基因，其余為非編碼中間序列。

Blast分析菌株JTC3的各甲烷單加氧酶組分基因及氨基酸序列結(jié)果如圖7，菌株JTC3與Methylocystis sp. M有較高的序列一致性，pmoC、pmoA和pmoB 3個(gè)基因序列的一致性均達(dá)到99%，對應(yīng)的氨基酸序列一致性分別為99%、100%和100%。菌株JTC3的pMMO與菌株M的pMMO序列高度一致，這與系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果一致。JTC3的16S rDNA與菌株M遺傳距離最近，進(jìn)一步證明了菌株JTC3是甲基孢囊菌屬的菌株，但菌株JTC3降解TCE效果明顯優(yōu)于菌株M。

圖6 Methylocystis sp. JTC3的pmoCAB基因簇分段擴(kuò)增電泳圖Fig. 6 Segmentation amplification of pmoCAB cluster from Methylocystis sp. JTC3. (A) pmoA gene segment. 1?3：pmoA gene segment. (B) The third time of semi-nested PCR. 1：pomC segment; 2：pmoB segment.

圖7 JTC3菌株與3株甲烷氧化菌的pMMO序列一致性比較Fig. 7 Comparision of sequences of pMMO genes from Methylocystis sp. JTC3 with several known methanetrophs.

與Methylocysti sp. SC2和Methylocystis sp. GSC357相比，菌株 JTC3的pMMO核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列一致性達(dá)到85%以上。4株菌的3個(gè)基因比較，pmoA序列在不同菌株間比較保守，對應(yīng)的氨基酸序列一致性達(dá)到94%以上，核苷酸序列一致性達(dá)到90%以上。

pmoCAB序列的種系發(fā)生與其16S rDNA高度一致[30]，在pmoCAB的3個(gè)功能基因中pmoA基因序列比較保守，近年來常被作為標(biāo)記基因研究不同環(huán)境中甲烷氧化菌的種群分布及數(shù)量變化[31-32]，在GenBank數(shù)據(jù)庫中報(bào)道也較多，但獨(dú)立注冊的pmoA基因大部分都在450?520 bp之間，沒有完整的pmoA閱讀框，本研究獲得了從起始密碼子ATG至終止密碼子TAA之間759 bp的完整pmoA基因開放閱讀框。

根據(jù)ExPASy的軟件包工具計(jì)算得到Methylocystis sp. JTC3中pMMO的α、β和γ亞基的理論等電點(diǎn)分別為6.56、6.96和5.05，理論分子量分別為45.6 kDa、28.6 kDa、29.1 kDa。Semrau等報(bào)道，pmoCAB編碼的pMMO的 α、 β和γ 3個(gè)亞基分子量分別約為46 kDa、28 kDa、29 kDa[33]，不同屬的甲烷氧化菌pMMO的α、β和γ亞基分子量有差別, Methylococcus capsulatus Bath中pMMO的3個(gè)對應(yīng)亞基的分子量分別為47 kDa、27 kDa和23 kDa[17]，而Methylosinus trichosporium OB3b中pMMO的3個(gè)對應(yīng)亞基的分子量分別為41 kDa、26 kDa和25 kDa[13]，甲基孢囊菌屬菌株pMMO的3個(gè)亞基分子量目前沒有確切的報(bào)道。根據(jù)氨基酸序列預(yù)測的pMMO理論分子量與實(shí)際接近。對于分離純化難度較大的蛋白質(zhì)，用分子生物學(xué)手段獲得其基因，并用軟件分析獲得部分生化參數(shù)是一個(gè)全新的思路。

3 結(jié)論與展望

Methylocystis sp. JTC3能夠高效降解TCE，且低濃度TCE能夠促進(jìn)其氧化甲烷，用16S rDNA對其鑒定為甲基孢囊菌屬的一個(gè)菌株，其pmoCAB基因簇共3 226 bp，且基因序列與Methylocystis sp. M的pmoCAB序列一致性較高，與同屬的SC2、GSC357序列一致性相對低。

Methylocystis sp. JTC3與Methylocystis sp. M的pMMO各組分中，只有pmoC對應(yīng)的γ亞基與Methylocystis sp. M有2個(gè)氨基酸殘基(D/S 5，T/A131) 不一致。Methylocystis sp. TJC3的第5位的天冬氨酸殘基含有1個(gè)游離羧基屬于酸性氨基酸殘基，第131位的蘇氨酸殘基含有一個(gè)游離羥基，與之對應(yīng)的Methylocystis sp. M 第5位絲氨酸殘基則含有極性羥基，第131位為丙氨酸殘基沒有游離的官能團(tuán)，這2個(gè)氨基酸殘基差別都涉及到與酶的活性中心有密切關(guān)系官能團(tuán)—羥基，2個(gè)氨基酸的差異性對其與底物結(jié)合能力是否有影響有待進(jìn)一步研究。

不同甲烷氧化菌間甲烷單加氧酶基因序列的差異決定了基礎(chǔ)代謝和生理功能的差異，同源性接近的菌株代謝模式本應(yīng)相似，但JTC3降解TCE效果明顯優(yōu)于菌株M，且菌株M對TCE的降解過程是sMMO起主導(dǎo)作用[34]，含有sMMO的甲烷氧化菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的TCE降解能力，只含有pMMO的甲烷氧化菌對TCE的降解能力強(qiáng)弱有別[35]，JTC3菌株通過共代謝作用降解TCE，且在降解過程中培養(yǎng)基中銅離子的濃度為10 μmol/L，該條件有利于提高pMMO的活性，不利于sMMO的表達(dá)，暗示在TCE降解過程中pMMO起主導(dǎo)作用，JTC3菌株共代謝TCE與pMMO的深層次關(guān)系有待進(jìn)一步研究。確切的pMMO氨基酸序列和高級結(jié)構(gòu)是了解不同菌株間代謝異同的前提，也為酶的定點(diǎn)改造提供了依據(jù)。pmoCAB基因簇測序?yàn)楦鱽喕牡孜锝Y(jié)合位點(diǎn)、酶促反應(yīng)活性中心特征、JTC3菌株對氯代烴類底物的選擇性及降解能力等的深入研究打下了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Sequence analysis of 16S rDNA and pmoCAB gene cluster of trichloroethylene-degrading methanotroph

Yunru Zhang1, Huaqing Chen1, Yanhui Gao2, Zhilin Xing2, and Tiantao Zhao2
1 School of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China
2 School of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China

methanotroph, trichloroethylene, pmoCAB gene cluster, 16S rDNA, phylogenetic tree

May 20, 2014; Accepted: August 14, 2014

Tiantao Zhao. Tel/Fax: +86-23-62563221; E-mail: tiantaozhao@gmail.com

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 51378522), Fundamental and Advanced Research Projects of Chongqing (No. cstc2013jcyjA20009).

國家自然科學(xué)基金 (No. 51378522)，重慶市基礎(chǔ)與前沿研究項(xiàng)目 (No. cstc2013jcyjA20009) 資助。

Abstract: Methanotrophs could degrade methane and various chlorinated hydrocarbons. The analysis on methane monooxygenase gene cluster sequence would help to understand its catalytic mechanism and enhance the application in pollutants biodegradation. The methanotrophs was enriched and isolated with methane as the sole carbon source in the nitrate mineral salt medium. Then, five chlorinated hydrocarbons were selected as cometabolic substrates to study the biodegradation. The phylogenetic tree of 16S rDNA using MEGE5.05 software was constructed to identify the methanotroph strain. The pmoCAB gene cluster encoding particulate methane monooxygenase (pMMO) was amplified by semi-nested PCR in segments. ExPASy was performed to analyze theoretical molecular weight of the three pMMO subunits. As a result, a strain of methanotroph was isolated. The phylogenetic analysis indicated that the strain belongs to a species of Methylocystis, and it was named as Methylocystis sp. JTC3. The degradation rate of trichloroethylene (TCE) reached 93.79% when its initial concentration was 15.64 μmol/L after 5 days. We obtained the pmoCAB gene cluster of 3 227 bp including pmoC gene of 771 bp, pmoA gene of 759 bp, pmoB gene of 1 260 bp and two noncoding sequences in the middle by semi-nested PCR, T-A cloning and sequencing. The theoretical molecular weight of their corresponding gamma, beta and alpha subunit were 29.1 kDa, 28.6 kDa and 45.6 kDa respectively analyzed using ExPASy tool. The pmoCAB gene cluster of JTC3 was highly identical with that of Methylocystis sp. strain M analyzed by Blast, and pmoA sequences is more conservative than pmoC and pmoB. Finally, Methylocystis sp. JTC3 could degrade TCE efficiently. And the detailed analysis of pmoCAB from Methylocystis sp. JTC3 laid a solid foundation to further study its active sites features and its selectivity to chlorinated hydrocarbon.