鄭冰玉，彭永臻，張亮，楊岸明，張樹軍

1 北京工業(yè)大學 北京市水質科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室 北京市污水脫氮除磷與過程控制工程技術研究中心，北京 100124

2 北京城市排水集團有限責任公司，北京 100022

污水處理系統(tǒng)中厭氧氨氧化菌分布及影響因素

鄭冰玉1，彭永臻1，張亮2，楊岸明2，張樹軍2

1 北京工業(yè)大學 北京市水質科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室 北京市污水脫氮除磷與過程控制工程技術研究中心，北京 100124

2 北京城市排水集團有限責任公司，北京 100022

鄭冰玉, 彭永臻, 張亮, 等. 污水處理系統(tǒng)中厭氧氨氧化菌分布及影響因素. 生物工程學報, 2014, 30(12): 1817?1827.

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基于厭氧氨氧化的污水生物脫氮工藝近年來發(fā)展迅速，污水處理系統(tǒng)中厭氧氨氧化菌的分布和多樣性成為了重要的研究方向。目前，在污水處理系統(tǒng)中曾檢測出多種厭氧氨氧化(Anaerobic ammonium oxidation，Anammox)菌，最常被檢測出的是待定布羅卡地菌Candidate Brocadia和待定斯圖加特庫氏菌Candidate Kuenenia的Anammox菌，并且研究發(fā)現單一生境下往往只存在一種類型的Anammox菌，但是影響Anammox菌分布和多樣性的因素與機制目前仍不明確。系統(tǒng)總結了污水處理系統(tǒng)中，不同工藝形式和運行條件下的Anammox菌分布情況，歸納分析了關鍵因素對Anammox菌分布的影響，包括底物濃度和微生物比生長速率、污泥性質與微生物生境、多重因素的聯(lián)合作用和影響等。在此基礎上，闡述了Anammox菌分布機制研究的工程意義，并對該領域的研究方向和思路進行了展望。

厭氧氨氧化菌，分布，影響因素，待定布羅卡地菌，待定斯圖加特庫氏菌

厭氧氨氧化 (Anammox) 菌在厭氧條件下能夠利用亞硝酸鹽作為氧化劑將氨氧化為氮氣。厭氧氨氧化現象在某反硝化流化床反應器被首次發(fā)現[1]，Strous等[2]在1999年確認這一新菌種的存在。目前，已經發(fā)現了5個屬的Anammox菌，它們均隸屬于浮霉狀菌門(Phylum Planctomycetales)[3]。其中最早發(fā)現的為待定厭氧氨氧化布羅卡地菌Candidatus Brocadia anammoxidans，此后研究者們又陸續(xù)發(fā)現了待定斯圖加特庫氏菌Candidatus Kuenenia stuttgartiensis、待定布羅達氏階梯烷菌Candidatus Scalindua brodae、待定韋格氏階梯烷菌Candidatus Scalindua wagneri、待定黑海階梯烷菌Candidatus Scalindua sorokinii、待定丙酸厭氧氨氧化球菌Candidatus Anammoxoglobus propionicus、待定亞洲杰特氏菌Candidatus Jettenia asiatica、待定熒光布羅卡地菌Candidatus Brocadia fulgida和待定硫酸鹽厭氧氨氧化球菌Candidatus Anammoxoglobus sulfate[4-5]。

Anammox菌廣泛分布于自然水生生態(tài)系統(tǒng)、陸地生態(tài)系統(tǒng)以及污水處理系統(tǒng)中。在自然水生生態(tài)系統(tǒng)中，較為常見的為Scalindua屬[6-8]，但也有部分環(huán)境中僅檢測到Brocadia屬[9-10]。相比之下，陸地生態(tài)系統(tǒng)中的Anammox種群多樣性水平更高，多種陸生環(huán)境中均檢測到了Kuenenia stuttgartinsis、Brocadia fulgida、Scalindua wagneri和Jettenia asiatica[11-12]。

Anammox菌在自然環(huán)境中的豐度、分布和多樣性研究，促進了環(huán)境微生物和地球物質循環(huán)領域的研究進展。該菌目前已經被成功地應用于污水處理，特別是高氨氮廢水處理系統(tǒng)中[13-15]，而在這一系統(tǒng)中，Kuenenia和Brocadia屬最為常見，但是有關這兩種菌在污水處理系統(tǒng)這一人工環(huán)境中的分布規(guī)律及其影響機制的研究仍然較少。本文主要對污水處理系統(tǒng)中的上述兩個Anammox菌屬分布情況以及相應的影響因素進行總結歸納，旨在對其生理生化性能和分布機制有更全面的了解，并對厭氧氨氧化工程實踐起到一定的指導意義。

1 污水處理系統(tǒng)中的Anammox菌

在不同的污水處理系統(tǒng)中，還有多種Anammox菌被檢測到：Liu等[16]在處理含硫酸鹽廢水的反應器中檢測到了Anammoxoglobus sulfate；Kindaichi等[17]在模擬海水的含鹽配水試驗中檢測到了Scalindua屬的Anammox菌；Quan等在運行顆粒污泥厭氧氨氧化反應器的過程中發(fā)現了新種Jettenia asiatica[18]。另外，有機酸如乙酸鹽和丙酸鹽的投加有利于Anammoxglobus propionicus的增殖[19]。然而，在實際污水處理廠以及用以污水處理的中試規(guī)模的生物反應器中，常被檢測到的只有Brocadia和Kuenenia屬的Anammox菌[14]，并且它們首次被發(fā)現均是在污水處理系統(tǒng)中。

1.1 Brocadia屬的Anammox菌

目前發(fā)現的Brocadia屬的Anammox菌共有兩種：Brocadia anammoxidands和Brocadia fulgida。

Brocadia anammoxidans是第一種被鑒定和富集的Anammox菌，發(fā)現于荷蘭的Gist-Brocades污水處理廠，并因此而得名[20]。該種大致呈球狀，細胞表面有火山口狀結構，細胞壁不含肽聚糖，細胞質內含有約占整個細胞30%?60% 的厭氧氨氧化體(Anammoxosome)，它可能是厭氧氨氧化發(fā)生的場所[21]。以亞硝酸為主要電子受體，以CO2為唯一碳源，不能利用小分子有機酸，如甲酸、丙酸等[4,22]。

Brocadia fulgida與Brocadia anammoxidans具有高達96% 的相似度，并且該種具有Anammox菌的一般特征：存在厭氧氨氧化體，厭氧氨氧化體脂中含有階梯烷 (Ladderane)，能在存在羥胺時產生聯(lián)氨。但是，這種細菌形成的大量胞外聚合物 (Extracellular polymer substances，EPS) 能夠發(fā)出明亮的自體熒光，這也是目前發(fā)現的所有Anammox菌中唯一的一種[23]。該種雖然同樣以亞硝酸為電子受體，以二氧化碳為碳源，但它在小分子有機酸如乙酸存在的情況下相對其他種具有競爭優(yōu)勢[24]。

1.2 Kuenenia屬的Anammox菌

目前發(fā)現的Kuenenia屬的Anammox菌只有Kuenenia stuttgartiensis一種。1999年，Schmid等首先在生物濾池中發(fā)現這一菌種[25]。

目前，Strous等已經完成了該細菌全基因組序列的測序工作[26]。Kuenenia屬與Brocadia屬具有較遠的親緣關系，相似度低于90%[23]。除了具有與前述Brocadia屬一致的細胞特征外，該種還有其特殊之處：可以利用有機酸進行硝酸鹽的還原，通過異化作用還原硝酸鹽到氨氮[27]。

2 Kuenenia與Brocadia在不同污水處理系統(tǒng)中的分布特點及影響因素

2.1 Kuenenia與Brocadia的分布情況

表1和表2列出了在幾種利用Anammox反應處理污水的系統(tǒng)中，典型Anammox菌Kuenenia和Brocadia的分布情況。在這些系統(tǒng)中，均只檢測到了Kuenenia和Brocadia其中的一種。從表中數據可以看出，在同樣的反應器形式下可觀察到不同的優(yōu)勢菌種，反應器形式對Anammox菌的種屬影響并不顯著。接種污泥Anammox菌的優(yōu)勢菌種也沒有決定性的作用。接種污泥中可能同時含有低豐度的Kuenenia與Brocadia，在反應器運行的過程中某些Anammox菌具有較高的生長速率，從而在長期運行過程中表現為優(yōu)勢菌種。此外，去除負荷對兩種菌的分布也無顯著影響，說明兩種Anammox菌均能應用于污水自養(yǎng)脫氮，并取得良好的去除效果。

表1 以Kuenenia為主要功能菌的污水處理系統(tǒng)Table 1 Sewage treating systems including Kuenenia as the main functional bacteria

微生物多樣性的影響因素眾多，作用機制復雜，從單一優(yōu)勢菌種的環(huán)境中難以直接歸納出Anammox菌的分布機制。但是人們發(fā)現在某些污水處理系統(tǒng)中，Kuenenia與Brocadia會共存于同一生境，如表3所示。這說明兩種菌之間沒有明顯的排斥作用，其分布主要是由生態(tài)位重疊產生的生長競爭引起的。此外，在運行過程中，當某些條件發(fā)生變化時，可觀察到Anammox菌由一種向另一種轉變的現象，進一步說明了兩種菌最佳生長條件不同可能是其分布的主要影響機制。根據以上試驗結果，本文將進一步分析影響Kuenenia和Brocadia生長的關鍵因素。

2.2 Kuenenia與Brocadia分布的主要影響因素和作用機制

由前文可見，各種控制參數甚至接種污泥等因素對于在各種系統(tǒng)中Anammox菌的種類都未見有決定性的影響；相比之下，以下各種因素的影響更加顯著，是影響Anammox菌分布的潛在原因。

表2 以Brocadia為主要功能菌的污水處理系統(tǒng)Table 2 Sewage treating systems including Brocadia as the main functional bacteria

表3 Brocadia與Kuenenia共存或存在Anammox菌種之間轉化的污水處理系統(tǒng)Table 3 Sewage treating systems including both Kuenenia and Brocadia or their mutual transformation

2.2.1 底物濃度和微生物比生長速率

厭氧氨氧化菌生長需要的底物包括亞硝酸鹽 (NO2--N)、總氮 (Total nitrogen，TN) 和無機碳源。不同種屬的厭氧氨氧化菌的底物親和能力有所不同，因此底物濃度和種類會影響厭氧氨氧化菌的生長速率，在特定的污泥齡條件下生長速率快的菌種逐漸被富集，成為優(yōu)勢菌種。

研究發(fā)現污水中NO2--N的濃度是影響污水處理系統(tǒng)中厭氧氨氧化菌的種類的關鍵因素之一，主要表現為Kuenenia對亞硝酸鹽的濃度比Brocadia有著更強的適應力，從而在與Brocadia的競爭中占據優(yōu)勢。Sun等[34]在育種過程中發(fā)現，當系統(tǒng)中亞硝酸鹽濃度成為抑制菌種生長的限制因素時，由于Kuenenia對亞硝酸鹽濃度的半飽和常數Ks (0.2?3 mmol/L) 低于Brocadia (5 mmol/L)，對亞硝酸鹽親和力更強的Kuenenia就更具有競爭性，在系統(tǒng)中逐漸被選擇出來，而Brocadia逐漸被淘汰。此外，在van der Star等[43]運行的MBR小試試驗中發(fā)現，當SRT (Sludge retention time，污泥齡) 為16 d時，在101 d內發(fā)生了菌種由Brocadia向Kuenenia的轉變。由此得出結論：在如此短的時間內，兩種Anammox菌的最大比生長速率μmax不足以成為影響菌種選擇的主要因素，對亞硝酸鹽濃度的半飽和常數Ks才是促進菌種轉變的最可能原因；亞硝酸鹽的半飽和常數Ks是選擇Kuenenia的主要策略 (即Kuenenia是生物進化策略中的K型策略者)，而最大生長速率μmax是選擇Brocadia的主要策略 (即Brocadia是生物進化策略中的r型策略者)。

由表1和表2可以看出，Kuenenia大多存在于處理TN濃度較高的污泥消化液[28-31]、養(yǎng)豬廢水[32]、垃圾滲濾液[33]等的工藝流程中，這可能同樣表明了該種相對于Brocadia，對較高的TN濃度具有更好的適應性。Yang等[45]發(fā)現，在較高的TN負荷 (5.2?11.8 kg N/m3·d) 下長期運行的反應器中，菌種發(fā)生了轉變，由起初的未知菌種KSU-1轉化為Kuenenia和另一未知菌種KU-2，這一結果也同樣證明了上述觀點。

有研究表明[45]，當碳源以高濃度的NaHCO3形式添加時，生物膜系統(tǒng)中的菌種發(fā)生了由未知菌種到Kuenenia的轉變，這說明該菌種對于無機物有較強的耐受力。此外，在存在小分子有機物如甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲胺和二甲胺的條件下，Brocadia fulgida相對于其他Anammox菌具有更強的競爭優(yōu)勢。根據計算，如果反硝化細菌能夠利用所提供的全部乙酸進行反硝化過程，Brocadia fulgida 將會占到全菌的40%，然而試驗中這一數字為70%?80%[24]。這說明該菌的細胞能夠將乙酸作為電子供體氧化亞硝酸鹽，也進一步表明Anammox反應能夠應用到富含有機物的污水中，如表2中的污泥消化液[15]、味精廢水[19]、養(yǎng)豬廢水[40]等。

2.2.2 污泥性質與微生物生境

除底物濃度和種類外，污泥性質與微生物的生存環(huán)境對其多樣性也有十分顯著的影響。

在污水處理系統(tǒng)中，研究發(fā)現在同一反應器中，不同的污泥聚集形態(tài)存在不同的優(yōu)勢菌種。Van der Star[43]等在顆粒污泥培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現，Anammox菌的優(yōu)勢菌種從接種污泥的Brocadia逐漸轉化為Kuenenia。Innerebner等[15]在DEMON反應器中發(fā)現在絮體污泥中Anammox細菌優(yōu)勢菌種為Kuenenia，顆粒污泥中Anammox細菌的優(yōu)勢菌種為Brocadiafulgida。在筆者所在的研究團隊內，兩段式Anammox顆粒污泥系統(tǒng)中，顆粒污泥所含Anammox菌97% 為Brocadia，僅有2% 為Kuenenia；在兩段式Anammox絮體污泥系統(tǒng)中，絮體污泥中93% 為Kuenenia，僅有7% 為Brocadia；在一體化Anammox顆粒污泥系統(tǒng)中，顆粒污泥所含的Anammox菌全部為Brocadia屬。主要原因可能在于顆粒污泥和生物膜系統(tǒng)中污泥結構密實[46]，且污泥中含有EPS，構成了整個結構的骨架；而在絮體污泥中，EPS的量要少于前者。此外，顆粒污泥和生物膜系統(tǒng)提供了利于Brocadia生長的環(huán)境，包括較長的世代時間，避免溶解氧的潛在抑制，也可能是其在兩種系統(tǒng)中占主導地位的重要原因。

污泥中EPS的含量及組成的變化是影響污泥聚集形態(tài)的重要原因，而EPS的分布與細菌所處的生長環(huán)境有關，并且各菌種EPS所含物質的比例也具有很大差異。對于Kuenenia和Brocadia兩種Anammox 菌，其EPS中所含多糖和細胞蛋白質的百分比分別為 (2.1±0.3)%和(1.0±0.2)%[46]。當EPS含量顯著降低時，已形成的Anammox顆粒污泥會迅速解體，系統(tǒng)內的優(yōu)勢菌種也會由Brocadia轉變?yōu)镵uenenia；此外，EPS組成上的變化會影響細菌的表面特征和物理特性，在厭氧顆粒污泥系統(tǒng)中，EPS多糖與蛋白質的比例在1∶6到1∶2之間[47]，這也反過來表明該比例更高的Brocadia更適應于生長在顆粒污泥的系統(tǒng)中。但是系統(tǒng)內污泥形態(tài)、污泥中的EPS和Anammox菌適宜的生境的相互關系仍缺乏直接的試驗證據，Anammox菌的適宜生境仍需要進一步的研究。

2.2.3 多重因素的聯(lián)合作用和影響

在污水處理系統(tǒng)內，存在影響Anammox菌分布的多種因素。這些因素相互影響，共同作用決定了系統(tǒng)中優(yōu)勢菌種的種類。比如系統(tǒng)中的亞硝酸鹽不僅是厭氧氨氧化菌的底物之一，也是影響污泥聚集形態(tài)和EPS的重要因素。隨著亞硝酸鹽濃度的提高，Anammox菌會受到抑制，而當亞硝酸鹽濃度達到100 mg/L時，這種抑制會導致污泥形態(tài)由顆粒裂解成絮體。這是因為：作為形成顆粒污泥骨架的EPS的主要成分為多糖和蛋白質，使得EPS的合成需要大量的腺嘌呤核苷三磷酸 (Adenosine triphosphate，ATP)，而高濃度的亞硝酸鹽會破壞跨膜質子梯度從而抑制ATP的合成，導致EPS的含量降低和顆粒污泥結構的瓦解[47]。顆粒污泥的形成更有利于Brocadia的生存，相反，當亞硝酸鹽濃度過高使得顆粒污泥裂解成絮體污泥后，雖然會導致污水處理效果的下降，但合理的降低亞硝酸鹽濃度，Kuenenia也會得到積累。

除此之外，鹽度也會對Anammox菌的多樣性和分布產生影響。提供適當的鹽度，能夠選擇性地富集培養(yǎng)出Kuenenia。Kartal等在兩個SBR (SBRsalt和SBRfresh) 中進行了淡水Anammox菌對鹽度適應的試驗。原泥取自一RBC反應器中，只含2%?5% 的Scalindua，在鹽度為30 g/L條件下經過4個月的培養(yǎng)，Anammox菌占總菌的70%?80%，其中含50%的Kuenenia和50% 的Scalindua；360 d時，在兩反應器里，Anammox菌仍能占到70%?80%，但在SBRfresh里99% 為Kuenenia，只有1% 為Scalindua；在SBRsalt里70% 為Kuenenia，30% 為Scalindua[27]。如果鹽度對淡水厭氧氨氧化菌Kuenenia有不良影響，當鹽度增長為30 g/L (海水鹽度) 時，Scalindua相對Kuenenia應該更有競爭優(yōu)勢，但事實上優(yōu)勢菌種仍為Kuenenia (70%)；并且在兩SBR中，厭氧氨氧化活性一致，說明其對反應過程是有貢獻的。該試驗結果表明，污水處理系統(tǒng)中可能同時存在多個條件，影響厭氧氨氧化菌種的分布和遷移轉化。因此在分析系統(tǒng)內厭氧氨氧化菌分布時，應充分考慮不同因素的相互關聯(lián)和影響。

3 工程意義

在污水系統(tǒng)中，除去特定水質條件下會存在Anammoxoglobus、Scalindua和Jettenia屬外，常見的Anammox菌種只有Brocadia和Kuenenia屬，因此研究它們的分布和影響其分布的因素顯得尤為重要，這一重要性主要體現為兩個方面。

3.1 揭示Brocadia和Kuenenia的生理生化特性

近年來，研究者們對于Brocadia和Kuenenia屬的Anammox菌的研究取得了許多突破性的進展，闡明了它們各自形態(tài)特征、細胞組分特征、富集與分離特性和生態(tài)學特征，提出了Anammox反應的數學模型，但是，對于二者的生態(tài)位分化的研究并不透徹。因此，將不同條件下運行的污水處理系統(tǒng)中Brocadia和Kuenenia分布情況進行總結歸納，得出其各自生長的最優(yōu)化條件，對探究其生理生化特性并最終獲得它們的純培養(yǎng)具有重要意義。

3.2 對現行污水處理廠的運行具有指導意義

在污水處理廠的設計階段，污水處理構筑物可以視為“黑箱”。如果了解不同屬Anammox菌所需的運行條件，即便不了解“黑箱”的內部結構，仍可以通過對輸入黑箱中的變量 (運行參數)進行控制，得到良好的處理效果。

在污水處理廠的啟動階段，通過合理控制Brocadia和Kuenenia生長繁殖的影響因素，可以實現反應器的快速啟動，最大限度的節(jié)約能源和運行成本。在污水處理廠的運行階段，可能由于某些限制性因素 (如處理構筑物的種類、經濟條件等)，需要特定的方式來運行反應器，就可以根據實際情況來選擇性地接種和富集Brocadia和Kuenenia中一種：如利用生物膜法或顆粒污泥法獲得Brocadia屬的Anammox菌，相應的，在絮體污泥中富集Kuenenia屬的Anammox菌；利用兩種菌不同的生長策略 (r型和K型)，在不同的基質濃度和比生長速率下，分別獲得兩種不同的菌屬。

4 展望

Anammox菌在污水處理系統(tǒng)中扮演著重要的角色，影響不同屬的Anammox菌在污水系統(tǒng)中分布的因素往往不是單一的，它們相互影響相互作用，最終選擇出適宜在不同條件下生存的Anammox菌。近年來，隨著科研手段的提高和理論水平的深入，人們對Anammox菌已經有了初步的認識；但總體而言，人們對于污水處理系統(tǒng)中Anammox菌的分布和影響因素及其機理還不夠明晰，仍有較多問題需要通過思路創(chuàng)新、方法創(chuàng)新和技術革新等進行深入研究：

1) 對不同生境下的各屬的Anammox菌進行富集培養(yǎng)，并獲得其純培養(yǎng)，闡明其各自的生理生化特性；

2) 不同的污水處理系統(tǒng)中，各種運行參數對不同屬的Anammox影響差異較大，需要全面考察系統(tǒng)中的所有影響因子，結合單一因素的影響深入分析其綜合效應；

3) 完善各屬尤其是Brocadia和Kuenenia屬的代謝模型，從微觀角度進一步明確它們的代謝途徑，為實際污水處理廠獲得穩(wěn)定高效的處理效果提供理論支持。

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(本文責編 陳宏宇)

Distribution and influence factors of Anammox bacteria in sewage treatment systems

Bingyu Zheng1, Yongzhen Peng1, Liang Zhang2, Anming Yang2, and Shujun Zhang2
1 Key Laboratory of Beijing Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering, Engineering Research Center for Sewage Nitrogen and Phosphorus Removal and Process Control of Beijing, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China
2 Beijing Drainage Group Co. Ltd., Beijing 100022, China

Anammox, distribution, influence factors, Brocadia, Kuenenia

February 20, 2014; Accepted: April 14, 2014

Yongzhen Peng. Tel/ Fax: +86-10-67392627; E-mail: pyz@bjut.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21177005), Project of Science and Technology of Beijing (No. D131100003913001).

國家自然科學基金 (No. 21177005)，北京市科技計劃項目 (No. D131100003913001) 資助。

Abstract: Nitrogen removal techniques based on Anammox process are developing rapidly these years. The distribution and diversity of Anammox have become important research directions. A variety of Anammox have been detected till now, of which only Kuenenia and Brocadia are often detected in wastewater treatment systems. In addition, in a single niche there is only one type of Anammox bacteria. However, the distribution mechanism and transformation of Anammox bacteria in different niches are still ambiguous. Therefore, the distribution of Anammox in various conditions was summarized and analyzed in this article. And the key factors influencing the distribution of Anammox were concluded, including substrate concentration and the specific growth rate, sludge properties and microbial niche, the joint action and influence of multiple factors. The engineering significance research on the distribution and influencing factors of Anammox bacteria in the sewage system and proposed research prospects were expounded.