宋雨夏，熊蕾，柴立元，廖騏，唐崇儉，閔小波，楊志輝

1 中南大學(xué)冶金與環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410083

2 國(guó)家重金屬污染防治工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410083

Anammox反應(yīng)器啟動(dòng)過程中顆粒污泥性狀變化特性

宋雨夏1,2，熊蕾1,2，柴立元1,2，廖騏1,2，唐崇儉1,2，閔小波1,2，楊志輝1,2

1 中南大學(xué)冶金與環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410083

2 國(guó)家重金屬污染防治工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410083

宋雨夏, 熊蕾, 柴立元, 等. Anammox反應(yīng)器啟動(dòng)過程中顆粒污泥性狀變化特性. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(12): 1854–1864.

Song YX, Xiong L, Chai LY, et al. Physicochemical and ecological characteristics of the granular sludge during start-up of Anammox reactor. Chin J Biotech, 2014, 30(12): 1854–1864.

以厭氧顆粒污泥作為接種物，通過185 d的運(yùn)行，成功啟動(dòng)了上流式厭氧氨氧化污泥床 (Upflow anaerobic sludge blanket, UASB) 反應(yīng)器。反應(yīng)器的進(jìn)水氨氮與亞硝氮濃度分別提升至224 mg/L和255 mg/L，容積氮去除速率提升至3.76 kg/(m3·d)。采用紅外光譜、掃描電鏡和透射電鏡等對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥的性狀進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)顆粒污泥在啟動(dòng)過程中經(jīng)歷了污泥顆粒裂解到污泥顆粒重組的過程，且厭氧氨氧化顆粒污泥表面含有豐富的官能團(tuán)，說明厭氧氨氧化顆粒污泥可能具有良好的吸附性能。采用宏基因組測(cè)序的方法對(duì)啟動(dòng)前后顆粒污泥的生態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)原接種污泥優(yōu)勢(shì)菌群 (變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門) 豐度大幅減少，厭氧氨氧化菌所屬的浮霉?fàn)罹T豐度則由1.59%提升到23.24%。

厭氧氨氧化，UASB反應(yīng)器，顆粒污泥，啟動(dòng)，理化性狀，生態(tài)結(jié)構(gòu)

隨著生產(chǎn)活動(dòng)增加和人們生活水平不斷提高，水體中的氨氮排放量急劇增加。傳統(tǒng)的硝化/反硝化生物脫氮工藝因其耗能大、需外加酸堿中和以及外加碳源等缺陷，難以滿足可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo)。厭氧氨氧化 (ANAMMOX，Anaerobic ammonium oxidation) 是一種新型高效的自養(yǎng)型生物脫氮工藝，可在缺氧條件下以亞硝酸鹽作為電子受體氧化氨而生產(chǎn)氮?dú)鈁1]。與傳統(tǒng)的硝化/反硝化工藝相比，厭氧氨氧化工藝無(wú)需曝氣和外加有機(jī)碳源，而且剩余污泥量少[2]。但由于厭氧氨氧化菌為自養(yǎng)型細(xì)菌，倍增時(shí)間長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢[1-3]，導(dǎo)致厭氧氨氧化污泥的培育過程十分緩慢，限制了厭氧氨氧化反應(yīng)器的快速啟動(dòng)。

污泥顆?；巧锓磻?yīng)器獲得高效性的重要技術(shù)手段[4-7]。顆粒污泥具有良好的沉降性能，易通過重力沉降持留于反應(yīng)器內(nèi)，提高反應(yīng)器內(nèi)的微生物濃度[8-9]。由于厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)緩慢，厭氧氨氧化顆粒污泥的培育尤其困難[1,3,10]。研究表明，選取常規(guī)顆粒污泥作為接種污泥直接富集培育厭氧氨氧化顆粒污泥可加快厭氧氨氧化顆粒污泥的培育過程。但對(duì)啟動(dòng)過程中顆粒污泥的理化性狀變化情況仍不甚明了。本研究以造紙廢水處理站厭氧內(nèi)循環(huán)反應(yīng)器獲取的厭氧顆粒污泥為接種污泥，以上流式厭氧污泥床 (UASB) 反應(yīng)器為載體，通過逐步提高進(jìn)水基質(zhì)濃度和縮短水力停留時(shí)間，成功啟動(dòng)了厭氧氨氧化反應(yīng)器，在此基礎(chǔ)上，研究了厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動(dòng)過程中顆粒污泥的變化特性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置選擇UASB反應(yīng)器，由有機(jī)玻璃制成，有效容積為1 L，外罩厚布以消除光照的負(fù)面影響[11-12]。廢水通過蠕動(dòng)泵從底部注入反應(yīng)器中，產(chǎn)生的氣體經(jīng)三相分離器收集后從反應(yīng)器頂部排出，泥水分離后的出水從反應(yīng)器上部排出[7,12]。通過反應(yīng)器外層的恒溫水浴夾套將反應(yīng)器內(nèi)的反應(yīng)溫度控制在 (32±1) ℃。如圖1所示，通過1∶1 HCl溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)器進(jìn)水pH為6.5?7.4。

1.2 試驗(yàn)廢水

試驗(yàn)采用模擬廢水，其組成為 (g/L) 為：NaH2PO40.01，CaCl2·2H2O 0.005 6，MgSO4·7H2O 0.3，KHCO31.25；微量元素濃縮液Ⅰ、Ⅱ各1.25 mL/L。微量元素濃縮液Ⅰ的成分為 (g/L)：EDTA 2.5，F(xiàn)eSO42.5；微量元素濃縮液Ⅱ的成分為 (g/L)：EDTA 15，CuSO4·5H2O 0.25，ZnSO4·7H2O 0.43，NaMoO4·2H2O 0.22，NiCl·6H2O 0.19，H3BO30.014[13]。NH4+-N和 NO2--N分別由 (NH4)2SO4和NaNO2提供，濃度按所需配制[14]。

1.3 接種污泥

試驗(yàn)采用厭氧顆粒污泥作為接種污泥，取自于湖南某造紙廠廢水處理站厭氧內(nèi)循環(huán) (IC)反應(yīng)器，黑色，粒徑約為1?2 mm，懸浮固體 (SS)和揮發(fā)性懸浮固體 (VSS) 分別為51.2 g/L和43.5 g/L，VSS/SS為0.85。取回后用清水反復(fù)沖洗，以洗凈污泥中殘留的有機(jī)物。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

氨氮采用水楊酸-次氯酸鹽光度法 (722型可見分光光度計(jì)) 檢測(cè)，亞硝氮采用N-(1-萘基)乙二胺分光光度法 (722型可見分光光度計(jì)) 檢測(cè)，硝氮采用紫外分光光度法 (Hitachi U-4100紫外可見光分光光度計(jì)) 檢測(cè)，pH采用雷磁PHBJ-260便攜式pH計(jì)測(cè)定，SS、VSS采用重量法測(cè)定，溫度采用水銀溫度計(jì)測(cè)定。

紅外光譜分析：從反應(yīng)器中取少量顆粒污泥，烘干后將樣品與溴化鉀混合后研磨20?30 s。將研磨后的樣品粉末用不銹鋼鏟轉(zhuǎn)移至底模面上并刮平，然后小心用柱塞將樣品壓平，再轉(zhuǎn)動(dòng)使粉末分布均勻，非常小心并慢慢拔出，然后放入頂模，其上放上柱塞，用10 t的油壓機(jī)壓片。壓片完畢后，將片頂出，放于片夾上記錄圖譜，以溴化鉀校正。

掃描電鏡觀察：取適量混培物樣品于2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定過夜，經(jīng) 0.1 mol/L，pH 7.0磷酸緩沖液洗滌3次后用1%餓酸鋨酸溶液固定1?2 h，接著用0.1 mol/L，pH 7.0磷酸緩沖液洗滌3次，再用梯度濃度乙醇 (包括50%、70%、80%、90%和100%) 進(jìn)行脫水處理，脫水處理后的樣品用1∶1乙醇醋酸異戊酯處理30 min，用純醋酸異戊酯處理l?2 h。最后將樣品置于臨界點(diǎn)干燥，鍍膜后用JSM-6360LV型掃描電鏡(日本電子JEOL公司) 觀察結(jié)果。

透射電鏡觀察：從反應(yīng)器中取出適量污泥樣品，先置于2.5%的戊二醛溶液中，經(jīng)4 ℃固定過夜后，用0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液漂洗，再用1%鋨酸溶液固定1?2 h，之后再用上述磷酸緩沖溶液漂洗。經(jīng)濃度梯度為50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液脫水處理后，分別用體積比為1∶1和3∶1的包埋劑與丙酮混合液處理1 h和3 h，最后將滲透樣品包埋，經(jīng)過70oC加熱過夜后，即得到包埋處理好的樣品。采用Reichert超薄切片機(jī)對(duì)包埋好的樣品進(jìn)行切片，獲得70?90 nm的切片，用檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液對(duì)切片各染色15 min，再用FEI Tecnai G2 Spirit進(jìn)行觀察拍片。

污泥群落結(jié)構(gòu)分析：采用宏基因測(cè)序的分析方法。通過離心獲得2 mL的污泥樣品，經(jīng)液氮冷凍后將細(xì)胞懸浮在磷酸鈉緩沖液中，再加入0.3 g，直徑0.25 mm的球磨珠，通過球磨(4 000 r/min) 獲得破碎細(xì)胞[15-16]，然后將細(xì)胞保存在50 mL的超純水中，并放入4 ℃下保存，采用土壤樣品試劑盒 (Omega公司) 提取細(xì)菌DNA；后將電泳檢驗(yàn)后的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增 (PCR擴(kuò)增所用的引物對(duì)為515F和806R，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)域，片段長(zhǎng)度為254 bp)、混樣、建庫(kù)并做相應(yīng)的檢測(cè) (諾和致源公司)。檢測(cè)合格的文庫(kù)采用Illumina Miseq/Hiseq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)器的啟動(dòng)過程及脫氮性能

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)過程可分為菌體自溶、活性遲滯、活性提高和活性穩(wěn)定4個(gè)階段[1,4,7-8]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，本文也將厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)過程分為4個(gè)階段，即1?22 d為菌體自溶期，23?104 d為活性遲滯期，105?135 d為活性提高期，136?185 d為活性穩(wěn)定期。

在菌體自溶期 (1?22 d)，反應(yīng)器出水氨氮濃度為84.85 mg/L，明顯高于進(jìn)水氨氮濃度 (平均進(jìn)水濃度為67.96 mg/L) (圖2A)，顯現(xiàn)出典型的菌體自溶特征[7]。在出水中沒有檢測(cè)到亞硝氮(圖2A)，表明反應(yīng)器內(nèi)可能發(fā)生了反硝化作用，將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氮?dú)鈁7]。

圖2 接種厭氧顆粒污泥的UASB反應(yīng)器啟動(dòng)性能Fig. 2 Performance of UASB seeded with anaerobic granular sludge during start-up. (A) Concentrations. (B) Removal efficiency.

第23?104天，反應(yīng)器進(jìn)出水氨氮濃度基本持平，沒有觀測(cè)到明顯的氨去除現(xiàn)象，表明反應(yīng)器處于活性遲滯期。與菌體自溶期相比，反應(yīng)器出水中的亞硝氮濃度為22.98 mg/L，亞硝氮去除率降低為70.11%，表明在活性遲滯期，反應(yīng)器內(nèi)的反硝化作用強(qiáng)度有所減弱。在該階段，反應(yīng)器內(nèi)部分顆粒污泥由黑色轉(zhuǎn)化為棕黃色，表明反應(yīng)器內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

第105天，反應(yīng)器出水氨氮濃度降低為4.59 mg/L，氨氮去除率躍升至66.22%，容積氮負(fù)荷由0.17 kg/(m3·d) 躍升至4.29 kg/(m3·d) 見圖2B，容積去除速率升高至2.16 kg/(m3·d)，此后氨氮去除率逐步升高，厭氧氨氧化功能持續(xù)增強(qiáng)，表明啟動(dòng)過程進(jìn)入活性提高階段，至第135 d，反應(yīng)器進(jìn)水氨氮和亞硝氮濃度分別提高至175.35 mg/L和218.06 mg/L，氨氮、亞硝氮去除率提高為77.78%和87.9%，反應(yīng)器容積氮去除速率提高為3.0 kg/(m3·d)，厭氧氨氧化成為反應(yīng)器內(nèi)的主導(dǎo)反應(yīng)。在該階段，反應(yīng)器內(nèi)棕黃色污泥區(qū)域逐漸擴(kuò)散，出現(xiàn)少量紅色顆粒污泥，說明反應(yīng)器內(nèi)生態(tài)結(jié)構(gòu)和活性繼續(xù)演變。

第135天后，在該階段，反應(yīng)器進(jìn)水氨氮和亞硝氮濃度逐漸升高至236 mg/L和255 mg/L，平均出水氨氮和亞硝氮濃度分別為40 mg/L和15 mg/L，平均氨氮和亞硝氮去除率分別為71.6%和83.5%，反應(yīng)器的容積氮去除速率不再隨進(jìn)水容積氮負(fù)荷的增加而升高，表明反應(yīng)器進(jìn)入活性穩(wěn)定期。

在活性提高期與活性穩(wěn)定期，反應(yīng)器的容積氮去除速率均高于文獻(xiàn)報(bào)道的厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動(dòng)成功的標(biāo)準(zhǔn) (0.5 kg/(m3·d))[17]，據(jù)此判定反應(yīng)器啟動(dòng)成功。另外，亞硝氮/氨氮計(jì)量比基本維持在1.3?1.4，與厭氧氨氧化的理論計(jì)量比 (1∶1.32) 基本符合，進(jìn)一步表明反應(yīng)器內(nèi)主要發(fā)生了厭氧氨氧化反應(yīng)。

2.2 顆粒污泥理化性狀變化

2.2.1 表觀性狀變化

接種污泥呈黑色，為橢球型顆粒，外表面光滑，粒徑約為1?2 mm。經(jīng)185 d運(yùn)行后，反應(yīng)器內(nèi)的污泥大多呈棕黃色以及紅色，紅色顆粒污泥粒徑約為2?3 mm，一些新生成的顆粒污泥表面凹凸不平，呈不規(guī)則團(tuán)塊狀。因厭氧氨氧化菌富含血紅素[18]，厭氧氨氧化顆粒污泥呈現(xiàn)出典型的紅色特征。

進(jìn)一步采用掃描電鏡對(duì)反應(yīng)器內(nèi)不同時(shí)期的顆粒污泥進(jìn)行了觀察。接種的厭氧顆粒污泥表面光滑，無(wú)附著物 (圖3A)，可觀察到少量絲狀菌。在啟動(dòng)過程中觀察到顆粒污泥表面變得粗糙，存在裂痕。因厭氧顆粒污泥從有機(jī)環(huán)境轉(zhuǎn)移到無(wú)機(jī)環(huán)境，污泥中大量異養(yǎng)菌死亡，這可能是導(dǎo)致污泥顆粒表面出現(xiàn)裂痕的主要原因。對(duì)新生成的紅色厭氧氨氧化顆粒污泥 (第140天) 進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)單個(gè)污泥顆粒表面粗糙，整個(gè)污泥由許多污泥亞單位聚集形成 (圖3E)，與文獻(xiàn)報(bào)道的厭氧氨氧化顆粒污泥結(jié)構(gòu)相似[19]；污泥表面主要為球菌，并且緊密聚集在一起，同時(shí)伴有少量桿菌 (圖3F)。研究表明，在胞外多聚物的作用下，厭氧氨氧化菌能夠緊密組合，形成一個(gè)個(gè)小的亞單位[19-20]。

2.2.2 顆粒表面官能團(tuán)性質(zhì)

研究表明，在微生物代謝過程中會(huì)產(chǎn)生許多分泌物，使污泥表面攜帶數(shù)量可觀的官能團(tuán)，如羥基、羧基、酯基等，使污泥具有良好捕集與吸附污染物 (如重金屬) 的性能。有關(guān)厭氧氨氧化顆粒污泥表面官能團(tuán)性質(zhì)，迄今未見報(bào)道。

啟動(dòng)前厭氧顆粒污泥的紅外吸收?qǐng)D譜如圖4所示，其中3 470 cm?1譜帶包括了胺基中-NH2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和醇類、糖類O-H的伸縮振動(dòng)；2 920 cm?1譜帶為 CH2的C-H不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；2 200?2 400 cm?1是蛋白質(zhì)和氨基酸、銨鹽類化合物中-NH4+的多重復(fù)合譜帶；1 650 cm?1譜帶為N-H的變形振動(dòng)與C=O伸縮振動(dòng)的共軛； 1 540 cm?1譜帶為酰胺 Ⅱ的N-H的變形振動(dòng)與C-N變形振動(dòng)的共軛；1 030 cm?1處的強(qiáng)峰為多糖或類似多糖物質(zhì)的C-O-C伸縮振動(dòng)。由此可見，厭氧顆粒污泥主要含有羥基、氨基、酰胺基、多糖及氨基酸等[21]。

圖4 反應(yīng)器啟動(dòng)前后顆粒污泥的紅外光譜Fig. 4 FTIR spectra for sludge before and after the start-up.

研究結(jié)果顯示，啟動(dòng)后的厭氧氨氧化顆粒污泥樣品在整個(gè)波數(shù)范圍 (4 000?400 cm?1) 內(nèi)均有明顯的吸收，表明其表面官能團(tuán)豐富。與厭氧顆粒污泥相比，主要的差別有：1) 圖譜中原3 300到3 500 cm?1處的譜帶峰強(qiáng)明顯增強(qiáng)，一些譜帶發(fā)生了微小偏移，如2 920 cm?1處CH2的C-H不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰偏移了5 cm?1且譜帶變寬，1 650 cm?1譜帶偏移4 cm?1，1 540 cm?1譜帶偏移6 cm?1，這可能與啟動(dòng)過程中的菌體自溶作用有關(guān)；2) 蛋白質(zhì)和氨基酸、銨鹽類化合物中-NH4+的多重復(fù)合譜帶峰強(qiáng)明顯減弱，可能與反應(yīng)器內(nèi)發(fā)生的厭氧氨氧化有關(guān)，污泥表面的-NH4+會(huì)進(jìn)入溶液而被厭氧氨氧化轉(zhuǎn)化；3)新出現(xiàn)的1 384 cm?1常常是腐殖物質(zhì)的特征光譜，由于在菌體自溶過程中會(huì)釋放有機(jī)物，這一譜帶的出現(xiàn)有可能進(jìn)一步揭示了污泥內(nèi)存在菌體自溶作用；1 242 cm?1是亞硝酸化合物的-NO2對(duì)稱伸縮振動(dòng)，這可能與長(zhǎng)期在反應(yīng)器體系中添加亞硝酸鹽有關(guān)。厭氧氨氧化顆粒污泥表面所具有的豐富官能團(tuán)表明其對(duì)一些特征污染物具有良好的吸附性能，這對(duì)于后續(xù)應(yīng)用厭氧氨氧化顆粒污泥處理含重金屬等污染物的氨氮廢水提供了新的思路。

2.3 顆粒污泥的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)變化

透射電鏡觀察結(jié)果表明，接種污泥中的細(xì)胞形態(tài)大部分呈現(xiàn)規(guī)則的圓形，同時(shí)伴有一些長(zhǎng)條狀細(xì)胞 (圖 5A)。由于接種污泥取自處理造紙廢水的IC反應(yīng)器，主要發(fā)生產(chǎn)甲烷作用，又因產(chǎn)甲烷八疊球菌是厭氧顆粒污泥中的重要組成部分[22]，推測(cè)接種污泥中觀測(cè)到的大量圓形細(xì)胞可能為產(chǎn)甲烷八疊球菌細(xì)胞。對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥的透射電鏡觀察結(jié)果 (圖 5B) 表明，其細(xì)胞多呈不規(guī)則的彎月狀或橢圓形。與文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)典厭氧氨氧化超微結(jié)構(gòu)比對(duì)，可以從圖中明顯辨別出厭氧氨氧化體(Anammoxosome，圖中黑色區(qū)域 (A))和外室細(xì)胞質(zhì) (Paryphoplasm，圖中透明區(qū)域 (P))等厭氧氨氧化菌細(xì)胞的特征結(jié)構(gòu)[20,23]，且?guī)讉€(gè)細(xì)胞之間通過胞外多聚物 (E) 粘合在一起[11]。

圖5 接種污泥 (A) 和反應(yīng)器啟動(dòng)后污泥 (B) 透射電鏡圖Fig. 5 TEM observation of the sludge before (A) and after (B) start-up.

為了進(jìn)一步探明啟動(dòng)前后顆粒污泥的生態(tài)結(jié)構(gòu)，采用宏基因組測(cè)序的方法對(duì)啟動(dòng)前后顆粒污泥的生態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。啟動(dòng)前后厭氧顆粒污泥 (T1)、厭氧氨氧化顆粒污泥 (T2) 的有效序列分別為106 608、67 435 (單位是百萬(wàn)，M)，平均片段大小為254 bp；對(duì)不同樣本在種、屬水平下的alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。其中，種水平下的alpha多樣性指數(shù)基于97%的序列相似性而得到，屬水平下的基于95%的序列相似性得到。結(jié)果如表1、表2、圖6所示。

接種污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、廣古菌門Euryarchaeota和厚壁菌門Firmicutes，其相對(duì)豐度分別為26.66、21.28、9.86和7.66% (表2)。其中，變形菌門、擬桿菌門以及厚壁菌門的細(xì)菌作為優(yōu)勢(shì)菌群被頻繁地發(fā)現(xiàn)于厭氧有機(jī)環(huán)境(如腸道、糞便以及厭氧反應(yīng)器)，具有降解纖維素、淀粉、長(zhǎng)鏈脂肪酸等功能[24-25]。產(chǎn)甲烷菌是廣古菌門的重要組成，故而在厭氧顆粒污泥中也占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。在厭氧顆粒污泥中檢測(cè)到了包含厭氧氨氧化菌的浮霉?fàn)罹T[26]，表明采用厭氧顆粒污泥作為接種物富集培育厭氧氨氧化菌在理論上是可行的，但因其相對(duì)豐度很低(1.59%)，表明其富集培育過程 (反應(yīng)器的啟動(dòng)過程) 必然是一個(gè)十分緩慢的過程。

表1 α多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index

表2 接種顆粒污泥和厭氧氨氧化顆粒污泥菌落組成及豐度Table 2 Composition and relative abundance of the sludge before and after start-up

圖6 反應(yīng)器啟動(dòng)前后顆粒污泥的生態(tài)結(jié)構(gòu) (T1接種厭氧顆粒污泥；T2厭氧氨氧化顆粒污泥)Fig. 6 The ecological structure of granular sludge before and after start-up (T1 seed sludge, T2 anammox granular sludge).

反應(yīng)器啟動(dòng)成功后，厭氧氨氧化顆粒污泥中的菌落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)了顯著變化，浮霉?fàn)罹T的豐度大幅提高為23.24%，相比于接種污泥增加了13.6倍，可以推斷，作為浮霉?fàn)罹T下的厭氧氨氧化菌已經(jīng)成為顆粒污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群。與厭氧顆粒污泥相比，在厭氧氨氧化顆粒污泥中的相對(duì)豐度明顯升高且占據(jù)優(yōu)勢(shì)還有廣古菌門、綠菌門Chlorobi和綠彎菌門Chloroflexi，其相對(duì)豐富分別為22.14%、11.07%和15.69%，分別提高了2.45、11.4和1.99倍。值得指出的是，廣古菌門因含有產(chǎn)甲烷菌而在厭氧顆粒污泥中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，但隨著無(wú)機(jī)環(huán)境的持續(xù)延長(zhǎng)，污泥中的產(chǎn)甲烷菌水解自溶所致的數(shù)量減少已經(jīng)不可避免，然而結(jié)果卻顯示廣古菌門細(xì)菌的豐度不降反升，這可能與氨氧化過程的重要微生物——氨氧化古菌 (Ammonia-oxidizing archaea，AOA) 相關(guān)。研究表明，AOA在低溶解氧條件下易被富集[27]，并可與厭氧氨氧化菌共存[27-29]。而綠彎菌門和綠菌門細(xì)菌均可進(jìn)行不產(chǎn)氧的光合作用，含有綠色色素，在反應(yīng)器運(yùn)行過程中，肉眼可觀測(cè)到反應(yīng)器沉淀區(qū)內(nèi)壁上附著有綠色的微生物，可能即與此有關(guān)。此外，由于無(wú)機(jī)環(huán)境的延續(xù)，原接種污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門的豐度均大幅減少至12.90%、3.41%和0.48%，分別降低了51.6%、84%和93.7%，進(jìn)一步驗(yàn)證了啟動(dòng)過程中的菌體自溶現(xiàn)象。

3 結(jié)論

經(jīng)過185 d的運(yùn)行，成功啟動(dòng)了厭氧氨氧化UASB反應(yīng)器。進(jìn)水氨氮與亞硝氮濃度分別由24 mg/L和28mg/L提升至224 mg/L和255 mg/L，氨氮去除率達(dá)97%，亞硝氮去除率為100%，容積氮負(fù)荷由0.30 kg/(m3·d) 提升至4.95 kg/(m3·d)，容積氮去除速率可提升至3.76 kg/(m3·d)。在啟動(dòng)過程中，顆粒污泥經(jīng)歷了裂解到重組的過程，且其中優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生了顯著變化，原接種污泥優(yōu)勢(shì)菌群 (變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門) 豐度大幅減少，包含厭氧氨氧化菌的浮霉?fàn)罹T細(xì)菌豐度由1.59%大幅度提升到23.24%。厭氧氨氧化顆粒污泥表面含有豐富的官能團(tuán)，表明其對(duì)水中的污染物具有潛在的吸附能力。

REFERENCES

[1] Strous M, Heijnen JJ, Kuenen JG, et al. The sequencing batch reactor as a powerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammonium-oxidizing microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 50(5): 589?596.

[2] Jetten MS, Strous M, Pas Schoonen KT, et al. The anaerobic oxidation of ammonium. FEMS Microbiol Rev, 1998, 22(5): 421?437.

[3] Tang CJ, Zheng P, Cheng JW. Effect of sequential biocatalyst addition on Anammox process. Chin J Biotech, 2011, 27(1): 1?8 (in Chinese).唐崇儉, 鄭平, 陳建偉. 流加菌種對(duì)厭氧氨氧化工藝的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27(1): 1?8.

[4] Tang C, Zheng P, Wang C, et al. Performance of high-loaded ANAMMOX UASB reactors containing granular sludge. Water Res, 2011, 45(1): 135?144.

[5] Thiele JH, Wu WM, Jain MK, et al. Ecoengineering high rate anaerobic digestion systems: analysis of improved syntrophic biomethanation catalysts. Biotechnol Bioeng, 1990, 35(10): 990?999.

[6] Franco A, Roca E, Lema JM. Granulation in high-load denitrifying upflow sludge bed (USB) pulsed reactors. Water Res, 2006, 40(5): 871?880.

[7] Tang CJ. Characteristics and control strategies of ANAMMOX process. Hangzhou: Zhejiang University, 2011 (in Chinese).唐崇儉. 厭氧氨氧化工藝特性與控制技術(shù)的研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2011.

[8] Zheng P, Lin F, Hu B, et al. Performance of Anammox granular sludge bed reactor started up with nitrifying granular sludge. J Environ Sci, 2004, 16(2): 339?342.

[9] Tang C, Zheng P, Mahmood Q, et al. Start-up and inhibition analysis of the Anammox process seeded with anaerobic granular sludge. J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36(8): 1093?1100.

[10] Van der Star WR, Abma WR, Blommers D, et al. Startup of reactors for anoxic ammonium oxidation: experiences from the first full-scale anammox reactor in Rotterdam. Water Res, 2007, 41(18): 4149–4163.

[11] van der Star WR, Miclea AI, van Dongen UG, et al. The membrane bioreactor: a novel tool to grow anammox bacteria as free cells. Biotechnol Bioeng, 2008, 101(2): 286–294.

[12] Xiong L, Wang Y, Tang C, et al. Start-up characteristics of a granule-based anammox UASB reactor seeded with anaerobic granular sludge. Biomed Res Int, 2013, 2013: 1–9.

[13] Van de Graaf AA, de Bruijn P, Robertson LA, et al. Autotrophic growth of anaerobic ammonium-oxidizing micro-organisms in a fluidized bed reactor. Microbiology, 1996, 142(8): 2187–2196.

[14] Zheng P, Hu BL. Study on growth kinetics ofanaerobic ammonia oxiadation biomass. Chin J Biotech, 2001, 17(2): 193–198 (in Chinese).鄭平, 胡寶蘭. 厭氧氨氧化菌混培物生長(zhǎng)及代謝動(dòng)力學(xué)研究. 生物工程學(xué)報(bào), 2001, 17(2): 193–198.

[15] Kowalchuk GA, Bruijn FD, Head IM, et al. Molecular Microbial Ecology Manual. Dordrecht: Springer, 2007.

[16] Hu B, Zheng P, Tang C, et al. Identification and quantification of anammox bacteria in eight nitrogen removal reactors. Water Res, 2010, 44(17): 5014–5020.

[17] Jin R, Zheng P, Hu A, et al. Performance comparison of two anammox reactors: SBR and UBF. Chem Eng J, 2008, 138(1): 224–230.

[18] Cirpus IE, Geerts W, Hermans JH, et al. Challenging protein purification from anammox bacteria. Int J Biol Macromol, 2006, 39(1): 88–94. [19] Lu H, Zheng P, Ji Q, et al. The structure, density and settlability of anammox granular sludge in high-rate reactors. Bioresour Technol, 2012, 123: 312–317.

[20] Lindsay MR, Webb RI, Strous M, et al. Cell compartmentalisation in planctomycetes: novel types of structural organisation for the bacterial cell. Arch Microbiol, 2001, 175(6): 413–429.

[21] Fan KN. Introduction of Spectroscopy. Beijing: Higher Education Press, 2001 (in Chinese).范康年. 物理化學(xué). 譜學(xué)導(dǎo)論. 北京: 高等教育出版社, 2001.

[22] Guo XL, Hu YY, Gao KR. Anaerobic granular sludge and its formation mechanism. Water Wastewater Eng, 2000, 26(1): 33–38 (in Chinese).郭曉磊, 胡勇有, 高孔榮. 厭氧顆粒污泥及其形成機(jī)理. 給水排水, 2000, 26(1): 33–38.

[23] Fuerst JA. Intracellular compartmentation in planctomycetes. Annu Rev Microbiol, 2005, 59: 299–328.

[24] Mao JJ. Vegetable waste prefromances of one-phase anaerobic digestion[D]. Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2010 (in Chinese).毛菁菁. 蔬菜廢物中溫單相厭氧消化性能研究[D]. 北京: 北京化工大學(xué), 2010.

[25] Zhang L, Gao G, Tang X, et al. Impacts of different salinities on bacterial biofilm communities in fresh water. Can J Microbiol, 2014, 60(5): 319–326.

[26] Strous M, Fuerst JA, Kramer EH, et al. Missing lithotroph identified as new planctomycete. Nature, 1999, 400(6743): 446–449.

[27] Park H, Wells GF, Bae H, et al. Occurrence of ammonia-oxidizing archaea in wastewater treatment plant bioreactors. Appl Environ Microb, 2006, 72(8): 5643–5647.

[28] Hu AY, Jiao NZ. ammonia oxidizing archaea --A hot study of environmental microbial ecology. Prog Nat Sci, 2009, 19(4): 370–379 (in Chinese).胡安誼, 焦念志. 氨氧化古菌——環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究的一個(gè)前沿?zé)狳c(diǎn). 自然科學(xué)進(jìn)展, 2009, 19(4): 370–379.

[29] Wang Y, Zhu GB, Wang CX, et al. Coexistence, biodiversity and roles of ammonia-oxidizing archaea and anaerobic ammonium-oxidizing bacteria in deep soil layer of high nitrogen loaded paddy field. J Ecol, 2011, (6): 1487–1493 (in Chinese).王雨, 祝貴兵, 王朝旭, 等. 高含氮稻田深層土壤的氨氧化古菌和厭氧氨氧化菌共存及對(duì)氮循環(huán)的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, (6): 1487–1493.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Physicochemical and ecological characteristics of the granular sludge during start-up of Anammox reactor

Yuxia Song1.2, Lei Xiong1.2, Liyuan Chai1.2, Qi Liao1.2, Chongjian Tang1.2, Xiaobo Min1.2, and Zhihui Yang1.2
1 School of Metallurgy and Environment, Central South University, Changsha 410083, Hunan, China
2 National Engineering Research Center for Heavy Metal Pollution Control, Changsha 410083, Hunan, China

The anaerobic granular sludge from an Internal Circulation (IC) reactor of a paper mill wastewater treatment plant were seeded in an Anammox upflow anaerobic sludge blanket reactor. After 185 days operation, the reactor was finally started up by increasing the influent ammonium and nitrite concentrations to 224 mg/L and 255 mg/L, respectively, with volumetric nitrogen removal rate increasing to 3.76 kg/(m3·d). The physicochemical characteristics of the cultivated Anammox granules were observed by scanning electron microscope, transmission electron microscope and FourierTransform infrared spectroscopy (FTIR). Results suggested that during the start-up course, the granular sludge initially disintegrated and then re-aggregated. FTIR spectra results revealed that the Anammox granular sludge contained abundant functional groups, indicating that it may also possess good adsorption properties. The ecological structure of the granular sludge, analyzed by the metagenomic sequencing methods, suggested that the relative abundance of the dominant bacterial community in the seeding sludge, i.e., Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, significantly reduced, while Planctomycetes which contains anaerobic ammonium oxidation bacteria remarkably increased from 1.59% to 23.24% in the Anammox granules.

Anammox, upflow anaerobic sludge blanket reactor, granular sludge, Start-up characteristic, physicochemical characteristics, ecological structure

May 7, 2014; Accepted: August 13, 2014

Chongjian Tang. Tel/Fax: +86-731-88830875; E-mail:chjtang@csu.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 51204213), the Special National Postdoctoral Science Foundation of China (No. 2013T60782), Key Project of the Science and Technology Program of Hunan Province (No. 2013WK2007).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 51204213)，中國(guó)博士后科學(xué)基金 (No. 2013T60782)，湖南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 2013WK2007) 資助。

Received: May 7, 2014; Accepted: August 13, 2014

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 51204213), the Special National Postdoctoral Science Foundation of China (No. 2013T60782), Key Project of the Science and Technology Program of Hunan Province (No. 2013WK2007).

Corresponding author: Chongjian Tang. Tel/Fax: +86-731-88830875; E-mail:chjtang@csu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 51204213)，中國(guó)博士后科學(xué)基金 (No. 2013T60782)，湖南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 2013WK2007) 資助。

Received: May 7, 2014; Accepted: August 13, 2014

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 51204213), the Special National Postdoctoral Science Foundation of China (No. 2013T60782), Key Project of the Science and Technology Program of Hunan Province (No. 2013WK2007).

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