羅蕾 史玉峰 崔丹丹 姜婻婻 王玲 王睿勇

摘要：利用自行分離得到的鏈霉菌B221固體發(fā)酵羽毛角蛋白，設(shè)置硫酸鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉和二硫蘇糖醇4種含硫化合物添加組，分析發(fā)酵后7 d的發(fā)酵物中角蛋白酶活力、可溶性蛋白含量以及各種含硫化合物的消長變化規(guī)律。結(jié)果表明添加的4種含硫化合物對角蛋白酶都具有激活作用，但沒有顯著增加發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白的含量；亞硫酸鹽含量、二硫鍵化合物含量和S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量之間存在著密切的相關(guān)性，B221固體發(fā)酵角蛋白過程中存在著亞硫酸鹽解作用；硫代硫酸鹽含量、二硫鍵化合物含量、S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量、巰基化合物含量之間存在著密切的相關(guān)性，B221固體發(fā)酵角蛋白過程中存在著另一種降解機制——硫代硫酸鹽解作用。

關(guān)鍵詞：羽毛角蛋白；降解；含硫化合物；硫解；亞硫酸鹽；硫代硫酸鹽

中圖分類號： Q935文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0310-04

收稿日期：2013-12-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：30571354）；江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2008405）。

作者簡介：羅蕾（1987—），女，湖南邵陽人，碩士研究生，從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。Tel：（025） 83592685。

通信作者：王睿勇。Tel：（025） 83592685；Email：wangry@nju.edu.cn。隨著全球家禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，在家禽加工處理過程中產(chǎn)生了大量的羽毛廢棄物。據(jù)食品與農(nóng)業(yè)政策研究協(xié)會（FAPRI）預(yù)測：2019年全世界雞肉產(chǎn)量預(yù)計達到7 936萬t，屆時將產(chǎn)生近600萬t雞毛[1]。這些羽毛中，除了少量用于制備氨基酸、蛋白質(zhì)飼料以及羽絨制品外，絕大部分都被直接丟棄到環(huán)境中，造成了大量的資源浪費，同時造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染[2]。

羽毛的主要成分是β角蛋白，粗蛋白含量可達80%以上，半胱氨酸和胱氨酸含量更是為天然蛋白質(zhì)飼料之冠。角蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不溶于水，也不能被胃蛋白酶、胰蛋白酶等水解[3]。傳統(tǒng)處理羽毛角蛋白的方法是利用物理、化學(xué)水解法，但存在能耗高、環(huán)境污染嚴(yán)重、三廢不易處理、某些必需氨基酸破壞嚴(yán)重、生產(chǎn)的羽毛粉消化率低等問題[4]。因此，利用生物技術(shù)途徑來解決角蛋白的分解利用近年來越來越受關(guān)注。

1963年，Nickerson等從弗氏鏈霉菌中分離到一種酶復(fù)合物，并在發(fā)酵液中檢測到大量巰基化合物，由此推論角蛋白的降解主要是由菌絲表面附著的角蛋白酶直接斷裂二硫鍵進行的，即酶降解途徑[5]。1989年Kunert在真菌石膏樣小孢子菌分解角蛋白的試驗中，從發(fā)酵液中檢測到亞硫酸鹽、硫酸鹽、少量巰基化合物和S-磺酸半胱氨酸，結(jié)合相關(guān)試驗證據(jù)認為該降解過程首先是亞硫酸鹽裂解二硫鍵（即亞硫酸鹽分解），然后亞硫酸分解變性的蛋白質(zhì)進一步被溶液中的蛋白酶降解，亞硫酸鹽分解作為微生物降解角蛋白過程中的一種非酶降解機制首次被提出[6]。Kunert用弗氏鏈霉菌降解角蛋白時，發(fā)酵液中未能檢測到亞硫酸鹽，硫酸鹽含量也很低，巰基化合物卻大量存在，硫代硫酸根為角蛋白中硫的主要轉(zhuǎn)化形式，由此認為該菌降解角蛋白是由角蛋白酶直接還原二硫鍵進行的[6]。2007年朱曉飛等利用鏈霉菌B221液體發(fā)酵進行了羽毛角蛋白降解機制的初探，結(jié)果表明硫酸鹽是角蛋白降解過程中硫元素的主要轉(zhuǎn)化形式，同時在發(fā)酵液中還檢測到了亞硫酸鹽，其含量變化與角蛋白酶活、降解率、可溶性蛋白、巰基化合物的變化存在很強的相關(guān)性，表明亞硫酸鹽分解作用在角蛋白降解中可能起到非常關(guān)鍵的作用[7]。2010年聶慶霽等利用地衣芽孢桿菌nju-1411-1液體發(fā)酵羽毛角蛋白，檢測到硫元素以硫酸根、亞硫酸根、硫離子、硫代硫酸根、巰基化合物、二硫鍵化合物、半胱氨酸、胱氨酸以及S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)等9種形態(tài)存在，其中硫酸根、亞硫酸根、硫代硫酸根和S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)是主要形態(tài)，亞硫酸根和S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)出現(xiàn)相互消長的關(guān)系，表明亞硫酸鹽分解作用的存在[8]。

本研究利用筆者所在實驗室自行篩選的鏈霉菌B221，研究角蛋白固體發(fā)酵過程中外源添加不同濃度的硫酸鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉和二硫蘇糖醇等四種含硫化合物對鏈霉菌B221角蛋白固體發(fā)酵過程的影響，加深對鏈霉菌B221降解角蛋白機制的認識，旨在為生物技術(shù)方法開發(fā)利用羽毛角蛋白資源奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

鏈霉菌B221，從畜禽場長年堆積羽毛等廢棄物的土壤中經(jīng)過富集培養(yǎng)和分離篩選獲得。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基[9]。

1.2試驗方法

1.2.1羽毛角蛋白的固體發(fā)酵在250 mL錐形瓶中裝入34 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入10 g羽毛，121 ℃滅菌20 min。冷卻后，加入1 mL 4種含硫化合物溶液，使發(fā)酵體系中含硫化合物的濃度分別達到1 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL，接種2 mL孢子懸液，40 ℃下培養(yǎng)。添加的含硫化合物經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾除菌。以不添加含硫化合物的發(fā)酵組作為對照。B221固體發(fā)酵羽毛角蛋白周期一般為7 d，在研究中于發(fā)酵后7 d取樣，進行含硫化合物含量和角蛋白酶活、可溶性蛋白含量測定。

1.2.2含硫化合物的提取及測定取2 g發(fā)酵物，加入 60 mL 去離子水，40 ℃ 150 r/min振搖1 h，中速定性濾紙過濾，用濾液測定各種含硫化合物的含量。硫酸根：鉻酸鋇分光光度法；亞硫酸根：改進的鹽酸副玫瑰苯胺法；硫化物：亞甲基藍分光光度法；巰基化合物：5，5′-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）光度法；二硫鍵：NTSB顯色法；硫代硫酸鹽：硫酸銅存在下的硫氰酸冷解法；半胱氨酸：酸性茚三酮顯色法；胱氨酸：二硫蘇糖醇裂解后，再采用酸性茚三酮顯色法；S-磺酸半胱氨酸：堿性條件下與氰化鈉反應(yīng)釋放出亞硫酸根離子的間接方法[7，10]。

1.2.3角蛋白酶活、可溶性蛋白含量測定測定方法參照文獻[11]。

2結(jié)果與分析

2.1外源添加含硫化合物對固體發(fā)酵過程中角蛋白酶活和可溶性蛋白的影響

從圖1可以看出，硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組的角蛋白酶活力比其他2個添加組的酶活力要高許多。硫酸鈉添加組在添加濃度為10 μmol/mL時酶活力最高，為 36.11 U/mL，比不添加組的酶活力增加了74.76%；二硫蘇糖醇添加組在添加濃度為1 μmol/mL時酶活力最高，為 28.39 U/mL，比不添加組的酶活力增加了37.34%；亞硫酸鈉添加組的角蛋白酶活力隨著添加濃度的增大而提高，但變化幅度不大；硫代硫酸鈉添加組的角蛋白酶活力隨著添加濃度的增大而有所下降。

從圖2可以看出，所有添加組的可溶性蛋白含量均比不添加組降低，其中硫酸鈉添加組和亞硫酸鈉添加組的可溶性蛋白含量隨著添加濃度的增大而減少，在添加濃度為 20 μmol/mL 時，可溶性蛋白含量分別為不添加組的62.57%和65.16%；硫代硫酸鈉添加組的可溶性蛋白含量隨著添加濃度的增大而提高，最高為15.5 mg/mL，為不添加組的9107%；二硫蘇糖醇添加組則隨著添加濃度的增大先降后升，但變化幅度不大。

2.2外源添加含硫化合物對固體發(fā)酵過程中含硫化合物的影響

從圖3可以看出，各含硫化合物添加組的亞硫酸鹽含量基本上都比不添加組降低，同一含硫化合物不同添加濃度之間相差不大，這可能是由于到了發(fā)酵后期，基本上已無羽毛成形結(jié)構(gòu)，亞硫酸鹽的生成量與消耗量基本持平，維持在一個穩(wěn)定水平。硫酸鈉添加組在添加濃度為20 μmol/mL時的亞硫酸鹽含量比其他2個添加濃度的低很多，為什么會產(chǎn)生這樣的變化，還需要進一步研究。亞硫酸鹽在羽毛角蛋白降解過程中主要起2方面的作用，一方面起亞硫酸鹽解作用，打開二硫鍵，破壞羽毛角蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；另一方面被微生物的氧化酶氧化成硫酸鹽，為微生物的生長提供快速硫源。

從圖4可以看出，亞硫酸鈉和硫代硫酸鈉添加組的 S-磺酸半胱氨酸含量隨著添加濃度的增大而增加，都比硫酸鈉和二硫蘇糖醇添加組高很多。亞硫酸鈉添加組最高達到了0349 μmol/mL，這是由于亞硫酸鹽解作用將二硫鍵裂解成了巰基化合物和S-磺酸半胱氨酸，添加的亞硫酸鈉量越多，通過亞硫酸鹽解作用產(chǎn)生的S-磺酸半胱氨酸也就越多。硫代硫酸鈉添加組S-磺酸半胱氨酸含量最高達到了 0731 μmol/mL，這可能是由于存在硫代硫酸鹽解作用，使得S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量增加，反應(yīng)式為：R—S—S—R+S2O2-3+H+→R—SH+R—S—SO3-+S2-。

硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組的S-磺酸半胱氨酸含量均比不添加組的低很多，可能是由于二者的添加對角蛋白酶的強烈激活，使得酶解作用成為羽毛角蛋白降解的主要機制，競爭性地消耗了二硫鍵化合物，因而導(dǎo)致由亞硫酸鹽解作用和硫代硫酸鹽解作用產(chǎn)生的S-磺酸半胱氨酸量減少。

從圖5可以看出，不添加組的二硫鍵化合物含量為 0518 μmol/mL，4種含硫化合物添加組的二硫鍵化合物含量

均比不添加組的低。其中亞硫酸鈉添加組的二硫鍵含量最低，且隨著添加濃度的增大而降低，這是由于亞硫酸鈉與二硫鍵發(fā)生亞硫酸鹽解作用，消耗了二硫鍵所致，這也可以從亞硫酸鈉添加組的S-磺酸半胱氨酸含量很高看出。硫代硫酸鈉添加組的二硫鍵含量也隨著添加濃度的增大而降低，推測可能也是由于硫代硫酸鈉與二硫鍵發(fā)生反應(yīng)，消耗了二硫鍵所致。

從圖6可以看出，除了亞硫酸鈉添加組在添加濃度為 10 μmol/mL 和20 μmol/mL時的巰基化合物含量比不添加高外，其他各添加組的巰基化合物含量均比不添加組低，這可能是由于亞硫酸鈉添加組添加的亞硫酸鈉進行了亞硫酸鹽解作用，產(chǎn)生了巰基化合物所致。其他含硫化合物添加組尤其是硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組，由于對角蛋白酶的強烈激活作用，使得巰基化合物的消耗加快，因而導(dǎo)致巰基化合物含量比不添加組的低。

從圖7可以看出，硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組的半胱氨酸含量均比不添加組低，這可能是由于它們的添加激活了角蛋白酶，導(dǎo)致微生物對半胱氨酸的利用加劇所致。硫代硫酸鈉添加組的半胱氨酸含量仍然隨著添加濃度的增大而增加，最高為0141 μmol/mL，是發(fā)酵后5 d的1.58倍，是不添加組的2.56倍。

從圖8可以看出，硫酸鈉添加組和亞硫酸鈉添加組的胱氨酸含量隨著添加濃度的增大而先增后降，其中硫酸鈉添加組的胱氨酸含量均比不添加組的低，亞硫酸鈉添加組在添加濃度為1 μmol/mL和10 μmol/mL時的胱氨酸含量比不添加組高，在添加濃度為10 μmol/mL時最高。硫代硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組的胱氨酸含量隨著添加濃度的增大而降低。

從圖9可以看出，除了硫代硫酸鈉添加組3個添加濃度和亞硫酸鈉添加組在添加濃度為10 μmol/mL和20 μmol/mL時的硫代硫酸鈉含量比不添加組的高外，其他含硫化合物添加組的硫代硫酸鈉含量均比不添加組低。其中亞硫酸鈉添加組的硫代硫酸鈉含量隨著亞硫酸鈉添加濃度的增大而增加，在添加濃度為20 μmol/mL時的硫代硫酸鈉含量最高，為 0411 μmol/mL，推測是由于還原性的亞硫酸鈉的存在，降低了硫代硫酸鈉的氧化速率。硫代硫酸鈉添加組的硫代硫酸鈉含量隨著添加濃度的增大而增加，在添加濃度為20 μmol/mL時的硫代硫酸鈉含量最高，為0491 μmol/mL，推測是由于添加了過量的硫代硫酸鈉，超過了利用限度所致。

從圖10可以看出，硫酸鈉添加組的硫酸鹽含量隨著添加濃度的增大而增加，在添加1 μmol/mL時，硫酸鹽濃度比不添加組的硫酸鹽濃度低；而在添加10 μmol/10 mL和 20 μmol/10 mL 時，硫酸鹽濃度均比不添加組的硫酸鹽濃度要高。這可能是由于添加較低濃度硫酸鈉時，硫酸鈉被鏈霉菌B211作為無機硫源而優(yōu)先利用掉，隨著添加濃度的增大，超過了鏈霉菌B221的利用速率，因而殘留的硫酸鹽濃度也逐漸增大。硫酸鹽作為角蛋白中硫元素的最終氧化產(chǎn)物，性質(zhì)比較穩(wěn)定，通常情況下，硫酸鹽的生成速率應(yīng)大于利用速率，在發(fā)酵產(chǎn)物中是逐步積累的。

3結(jié)論

到目前為止，已知能分解利用角蛋白的微生物有30余種，但針對含硫化合物添加對羽毛角蛋白降解過程，特別是固體發(fā)酵的影響所進行的研究幾乎沒有。本研究以筆者所在實驗室自行篩選到的鏈霉菌B221為材料，系統(tǒng)研究了羽毛角蛋白固體發(fā)酵過程中4種外源含硫化合物的添加對羽毛角蛋白固體降解過程的影響，發(fā)現(xiàn)：（1）添加的4種含硫化合物對角蛋白酶都具有激活作用，但沒有顯著增加發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白的含量；（2）亞硫酸鹽含量、二硫鍵化合物含量和 S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量之間存在著密切的相關(guān)性，再次證明了在B221固體發(fā)酵角蛋白過程中確實存在著亞硫酸鹽解作用；（3）硫代硫酸鹽含量、二硫鍵化合物含量、S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量、巰基化合物含量之間存在著密切的相關(guān)性，表明在B221固體發(fā)酵角蛋白過程中確實存在著另一種降解機制——硫代硫酸鹽解作用。

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