周萬里，張京聲，張世湘，郝彥玲

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

0 引 言

乳酸菌細(xì)菌素的抑菌范圍不局限于近緣菌，也可殺死和抑制食品中的一些腐敗菌和病原菌[1]。細(xì)菌素進(jìn)入人體后能夠被消化道內(nèi)各種蛋白酶消化，低毒、無副作用。IIa類細(xì)菌素對單增李斯特氏菌具有強(qiáng)的抑制作用，因此對IIa類細(xì)菌素抑菌機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)[2-3]。

甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)IICD組分是IIa類細(xì)菌素的受體，細(xì)菌素結(jié)合受體，破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4-6]。細(xì)菌素的同源免疫蛋白與受體-細(xì)菌素復(fù)合物的相互作用阻止細(xì)菌素對細(xì)胞的致死作用[6-8]。然而，免疫蛋白與受體結(jié)合的具體機(jī)制尚未闡述清楚。本研究在乳酸乳球菌中分別表達(dá)植物乳桿菌來源的mptIICD、腸膜明串珠菌來源的ptlIICD與免疫蛋白pedB，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫蛋白在與受體結(jié)合中存在特異性識(shí)別。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

(1)菌株和質(zhì)粒。產(chǎn)細(xì)菌素菌株植物乳桿菌BM-1分離自產(chǎn)于福建省的發(fā)酵魚制品，對細(xì)菌素敏感的植物乳桿菌WQ0815和腸膜明串珠菌05-43、乳酸乳球菌NZ9000及質(zhì)粒pNZ8148由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pNZ8148的遺傳圖譜如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒pNZ8148的遺傳圖譜

(2)培養(yǎng)基和試劑。植物乳桿菌和腸膜明串珠菌培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基，乳酸乳球菌培養(yǎng)采用GM17培養(yǎng)基。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶和DNA Marker；質(zhì)粒提取試劑盒；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

(3)引物合成。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及用途如表1所示。

表1 引物序列及用途

1.2 方法

1.2.1 對片球菌素BM-1敏感菌株的篩選

細(xì)菌素制備：活化后的植物乳桿菌BM-1發(fā)酵液以1%的接種量接種于1L MRS的液體培養(yǎng)中，37℃培養(yǎng)24 h，6 000 r/min離心15 min，收集上清液。將發(fā)酵上清液調(diào)至pH值為6.0，置于磁力攪拌器上，緩慢加入硫酸銨至最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%。4℃放置2 h后6 000r/min離心15 min，棄上清，將沉淀重懸于濃度為0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液中，離心除去殘留的不溶物，0.22 μm濾膜除菌得到細(xì)菌素溶液。

抑菌實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法[9]：以實(shí)驗(yàn)室保存20株乳酸菌為目標(biāo)菌株，利用牛津杯法篩選對細(xì)菌素敏感的乳酸菌。

1.2.2 載體pNZmptIICD和pNZptlIICD的構(gòu)建

對于乳酸菌表達(dá)載體pNZmptIICD構(gòu)建，首先以植物乳桿菌WQ0815基因組為模板，利用引物mptⅡCD-F和mptⅡCD-R擴(kuò)增甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶ⅡCD組分的編碼基因mptⅡCD，采用NcoI和XhoI分別雙酶切PCR產(chǎn)物和載體pNZ8148，將酶切后的PCR產(chǎn)物和載體在T4-DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ9000，將其涂布于含氯霉素(5 μg/mL)的MRS平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h。 將得到的攜帶mptⅡCD基因的重組質(zhì)粒命名為pNZmptIICD。對于乳酸菌表達(dá)載體pNZptlⅡCD的構(gòu)建，載體構(gòu)建策略與pNZmptⅡCD相同。首先以腸膜明串珠菌05-43的基因組為模板，利用引物ptlⅡCD-F和ptlⅡCD-R擴(kuò)增甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶IICD組分的編碼基因ptlⅡCD，將其構(gòu)建到載體pNZ8148，將得到的攜帶ptlIICD基因的重組質(zhì)粒命名為pNZptlIICD。

1.2.3 載體pNZmptB和pNZptlB的構(gòu)建

以植物乳桿菌BM-1的基因組為模板，利用引物pedB-F和pedB-R擴(kuò)增免疫蛋白編碼基因pedB，利用XhoI和XbaI雙酶切pedB的PCR產(chǎn)物，在T4-DNA連接酶的作用下分別與經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切回收的載體pNZmptIICD和pNZptlIICD進(jìn)行連接，將得到的攜帶mptIICD和pedB基因的重組質(zhì)粒命名為pNZmptB，攜帶ptlIICD和pedB基因的重組質(zhì)粒命名為pNZptlB。

1.2.4 重組菌株對片球菌素BM-1的敏感性檢測

采用牛津杯法，以各重組菌株 (攜帶空載質(zhì)粒pNZ8148的乳酸乳球菌(NZ9101)、攜帶質(zhì)粒pNZmptIICD的乳酸乳球菌(NZ9104)、攜帶質(zhì)粒pNZptlIICD的乳酸乳球菌(NZ9113)、攜帶質(zhì)粒pNZmptB的乳酸乳球菌 (NZ9106)及攜帶質(zhì)粒pNZptlB的乳酸乳球菌(NZ9114))為指示菌，檢測這些菌株對片球菌素的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對片球菌素BM-1敏感的乳酸菌篩選

以實(shí)驗(yàn)室保存的20株乳酸菌為出發(fā)菌株，利用牛津杯法篩選對片球菌素敏感的乳酸菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明植物乳桿菌WQ0815和腸膜明串珠菌05-43對片球菌素BM-1敏感(圖2)。

圖2 WQ0815和05-43的敏感性分析

2.2 載體pNZmptIICD和pNZptlIICD的構(gòu)建

以植物乳桿菌WQ0815基因組為模板擴(kuò)增mptIICD基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見一條約1.8kb的條帶，與預(yù)期大小相符。將NcoI和XhoI雙酶切回收的mptIICD基因和pNZ8148載體進(jìn)行連接，重組質(zhì)粒pNZmptIICD經(jīng)PCR鑒定獲得預(yù)期大小1.8kb的目的片段，經(jīng)NCBI/Blast比對確定目的片段與植物乳桿菌ST-III中IICD的同源性達(dá)99%。證明攜帶mptIICD基因的乳酸菌表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖3)。同時(shí)以相同的方法獲得攜帶ptlIICD基因的乳酸菌表達(dá)載體pNZptlIICD(圖4)。

圖3 重組質(zhì)粒pNZmptIICD的PCR鑒定

圖4 重現(xiàn)質(zhì)粒pNZptlIICD的PCR鑒定

2.3 載體pNZmptB和pNZptlB的構(gòu)建

以植物乳桿菌BM-1基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增pedB基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見一條約300 bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小相符。將XhoI和XbaI雙酶切回收的pedB基因分別和經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切回收的pNZmptIICD、pNZptlIICD載體進(jìn)行連接。重組質(zhì)粒pNZmptB和pNZptlB經(jīng)PCR鑒定獲得預(yù)期大小300bp的目的片段，經(jīng)DNAMAN比對確定目的片段與植物乳桿菌BM-1中片球菌素BM-1同源免疫蛋白的同源性達(dá)100%。證明攜帶pedB基因的乳酸菌表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖5)。

圖5 重組質(zhì)粒pNZmptB和pNZptlB的PCR鑒定

2.4 免疫蛋白與受體相互作用的驗(yàn)證

首先對兩種不同來源的受體在宿主乳酸乳球菌中的有效性進(jìn)行驗(yàn)證。由圖6可知攜帶空載質(zhì)粒pNZ8148的乳酸乳球菌(NZ9101)對片球菌素BM-1不敏感，而攜帶質(zhì)粒pNZmptIICD和pNZptlIICD的乳酸乳球菌 (NZ9104和NZ9113)對片球菌素BM-1敏感，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明植物乳桿菌中WQ0815的mptIICD和腸膜名串珠菌05-43的ptlIICD在NZ9000中表達(dá)可作為片球菌素BM-1的受體，使得對片球菌素BM-1不敏感的NZ9000對片球菌素BM-1敏感。

由圖6同時(shí)可知攜帶重組質(zhì)粒pNZmptB的乳酸乳球菌(NZ9106)對片球菌素BM-1不敏感，而攜帶重組質(zhì)粒pNZptlB的乳酸乳球菌 (NZ9114)對片球菌素BM-1敏感。結(jié)果說明：免疫蛋白在NZ9000中表達(dá)后可識(shí)別植物乳桿菌的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶IICD組分mptIICD，同時(shí)結(jié)合片球菌素BM-1，三者結(jié)合形成免疫蛋白-受體-細(xì)菌素復(fù)合物，阻止細(xì)菌素的抑菌作用，導(dǎo)致宿主菌對片球菌素BM-1產(chǎn)生抗性；而免疫蛋白不識(shí)別腸膜明串珠菌的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶IICD組分ptlIICD，從而導(dǎo)致宿主菌對片球菌素BM-1敏感。

圖6 重組菌株的敏感性分析

3 結(jié) 論

目前，對IIa類細(xì)菌素抑菌機(jī)制的研究主要集中在細(xì)菌素、受體及免疫蛋白三者的相互作用。IIa類細(xì)菌素N端β折疊區(qū)域特異性識(shí)別位于甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)IIC組分N端的胞外環(huán)，兩者結(jié)合形成的復(fù)合物導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)致死孔洞[10，11]。在產(chǎn)細(xì)菌素菌株胞內(nèi)，免疫蛋白通過識(shí)別細(xì)菌素-受體復(fù)合物阻止細(xì)菌素的抑菌作用，而免疫蛋白與細(xì)菌素的識(shí)別作用表現(xiàn)出高度的特異性[8,12,13]。本文重點(diǎn)研究免疫蛋白和受體的特異性識(shí)別情況，首先分別在乳酸乳球菌NZ9000中誘導(dǎo)表達(dá)兩種不同來源的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)IICD組分，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩種受體可識(shí)別結(jié)合片球菌素BM-1。進(jìn)一步在乳酸乳球菌NZ9000中誘導(dǎo)表達(dá)植物乳桿菌WQ0815來源的IICD組分mptIICD和免疫蛋白pedB，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：免疫蛋白pedB可識(shí)別片球菌素BM-1與mptIICD組分，形成復(fù)合物免疫蛋白-片球菌素-mptIICD，阻止片球菌素BM-1的抑菌作用。在乳酸乳球菌中誘導(dǎo)表達(dá)腸膜明串珠菌05-43來源的IICD組分ptlIICD和免疫蛋白pedB，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：免疫蛋白不能識(shí)別ptlIICD組分，導(dǎo)致復(fù)合物片球菌素-ptlIICD殺死細(xì)胞。研究結(jié)果證明了免疫蛋白對受體存在特異性識(shí)別，為免疫蛋白與受體作用的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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