王 多，李寧馨，劉桂宇，董素蓉，柴惠霞**

(1.河北師范大學(xué)，河北 石家莊 050024；2.河北女子職業(yè)學(xué)院，河北 石家莊 050091)

蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)多糖提取及其抗氧化作用*

王 多1，李寧馨1，劉桂宇1，董素蓉2，柴惠霞1**

(1.河北師范大學(xué)，河北 石家莊 050024；2.河北女子職業(yè)學(xué)院，河北 石家莊 050091)

對(duì)蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)多糖進(jìn)行提取純化，通過(guò)體外氧化反應(yīng)體系評(píng)價(jià)蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖及精多糖總還原力、羥自由基清除能力及不同濃度時(shí)蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖羥自由基清除能力。結(jié)果表明，蛹蟲(chóng)草粗多糖總還原力為0.182，羥自由基清除率為84.4%，且隨多糖濃度上升，羥自由基清除率增大。蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)精多糖總還原力為0.136，羥自由基清除率為55.3%。蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖總還原力、羥自由基清除率均優(yōu)于蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)精多糖。由此推斷蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)中多糖種類(lèi)繁雜，并非單一多糖，其中含有多種抗氧化功能的多糖，且多糖之間的抗氧化功能可能存在協(xié)同作用。

蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)；多糖提??；抗氧化

蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)(Cordycepsmilitaris)是真菌門(mén)(Eumycota)、子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)、麥角菌目(Clavicipitales)、麥角菌科(Clavicepitaceae)、蟲(chóng)草屬(Cordyceps)的模式種，俗名又稱(chēng)蟲(chóng)草花、北蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)、北冬蟲(chóng)夏草等，是1種珍貴的食藥兼用的真菌[1，2]。蛹蟲(chóng)草的有效成分和藥效與天然冬蟲(chóng)夏草高度相似，在藥化、藥理和臨床實(shí)驗(yàn)中被證明可作為冬蟲(chóng)夏草的重要人工替代品[3，4]。近年來(lái)，隨著蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)藥用保健等功能的不斷應(yīng)用和人工繁殖技術(shù)日趨成熟，市場(chǎng)上存在大量人工培育的蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)，但質(zhì)量差距較大[5]。不同蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌株的蟲(chóng)草多糖含量不同，并且同一菌株因?yàn)榕囵B(yǎng)基等因素的差異，也會(huì)導(dǎo)致多糖含量的變化[6]。蟲(chóng)草多糖是蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)中含量最高的藥理活性物質(zhì)，具有良好的抗鹽性、增稠性、觸變性、耐熱性等[7，8]，可調(diào)節(jié)人體免疫功能，且在抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖、抑菌、改善肝功能等方面均有顯著功效[9-15]。

本研究以石家莊創(chuàng)新食用菌研究所提供的蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌絲為實(shí)驗(yàn)材料，分析了菌絲多糖含量、羥自由基清除率、總還原力以及粗多糖不同濃度時(shí)對(duì)羥自由基清除率，進(jìn)一步篩選多糖產(chǎn)量高、抗氧化活性好的蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)提供依據(jù)，為蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)保健品在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 樣品來(lái)源

以小麥為培養(yǎng)基的蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌絲(石家莊創(chuàng)新菌類(lèi)研究所提供)，將樣品干燥后研磨成粉末待測(cè)。

1.2 儀器與試劑

uv-5分光光度計(jì)、立式搖床等。濃硫酸、重蒸苯酚、葡萄糖等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)多糖的提取、分離和純化

2.1.1 提取工藝

以烘干的蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌絲為實(shí)驗(yàn)組，以烘干的小麥培養(yǎng)基為對(duì)照組，分別粉碎后用無(wú)水乙醇提取6 h以除去單糖和脂溶性成分，烘干。殘?jiān)?0℃條件下用水提取3次，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，加入無(wú)水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，離心，得沉淀。沉淀溶于水，Savage法除去蛋白質(zhì)，再用50%乙醇沉淀，冷凍干燥后獲得蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌絲粗多糖和對(duì)照組多糖[16]。

2.1.2 凝膠過(guò)濾法分離純化

Sephadex G-75置直徑為3 cm的層析柱，0.1 mol·L-1的NaCl溶液平衡。洗脫液流速0.5 mL·min-1，將實(shí)驗(yàn)組樣品溶解于1 mL水中，過(guò)柱；部分收集器收集洗脫液50管，每管3 mL；定量取各管收集液0.2 mL，苯酚硫酸法測(cè)含量，分光光度計(jì)490 nm處測(cè)OD值。

2.2 多糖含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱(chēng)取干燥至恒重的葡萄糖50 mg，置于 1 000 mL 量瓶中，配成50 μg·mL-1濃度的葡萄糖溶液。取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于試管中，加水至2 mL。加入0.5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入硫酸5 mL，搖勻后放置10 min。置25℃水浴中15 min，取出冷卻至室溫，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算葡萄糖含量C與吸光值A(chǔ)的回歸方程：A= 4.3085C+ 0.2307，R2=0.9992。

2.2.2 待測(cè)品測(cè)定

精密量取供試液，按 2.2.1 方法操作，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

2.3 抗氧化分析

2.3.1 總還原力測(cè)定

具塞試管中加樣品、磷酸鈉緩沖溶液及1%K3[Fe(CN)6]，置于50℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，再加入10%C2HCl3O2溶液，取反應(yīng)液1.5 mL，加3.0 mL水和0.2 mL1% FeCl3溶液，混合均勻，5 min后于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光值[17]。

2.3.2 羥自由基清除能力測(cè)定

利用 Fenton反應(yīng)測(cè)定蟲(chóng)草多糖對(duì)亞鐵離子催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生的羥自由基清除能力[18]。反應(yīng)體系含有H2O21 mL、FeSO41 mL、水楊酸-乙醇1 mL、3種多糖溶液(濃度 30mg·mL-1)1 mL。最后加H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，以蒸餾水作為參比，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定各濃度的吸光度值。每個(gè)濃度重復(fù)3次，取吸光度值的平均值。·OH清除率的計(jì)算公式為：

P=[A0-(AX-AX0)]A0×100%

式中：A0為空白對(duì)照液吸光度值，只加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過(guò)氧化氫，不加入蟲(chóng)草多糖溶液的吸光度值；AX為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過(guò)氧化氫、蟲(chóng)草多糖的吸光度值；AX0為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、蟲(chóng)草多糖溶液，不加過(guò)氧化氫引發(fā)反應(yīng)的吸光度值。

2.3.3 不同濃度的蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖羥自由基清除率的比較

利用Fenton反應(yīng)測(cè)定蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)羥自由基的清除能力。將蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)精多糖精確配制為濃度30 mg·mL-1，用蒸餾水將該溶液稀釋為6種濃度：5 mg·mL-1、10 mg·mL-1、15 mg·mL-1、20 mg·mL-1、25 mg·mL-1、30 mg·mL-1，其余按2.3.2方法操作于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 凝膠色譜法洗脫曲線

以NaCl溶液對(duì)蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖和對(duì)照組分別進(jìn)行洗脫，前者洗脫曲線如圖1所示，后者脫曲線如圖2所示。

圖1、圖2對(duì)比得知，蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖吸光度峰值較對(duì)照組高數(shù)倍，且前者多糖集中于10管～14管，后者多糖集中于9管～14管。收集蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖峰面積最大洗脫峰，脫鹽，濃縮后分別得到蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)小麥精多糖。

3.2 多糖含量測(cè)定

蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌絲多糖、對(duì)照組多糖含量情況見(jiàn)表1。

表1 蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌絲和對(duì)照組多糖含量

注：表中數(shù)據(jù)為均值±SD；同行數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母分別表示差異顯著(p<0.05，t-test)。

由表1可見(jiàn)，蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌絲中多糖含量大于對(duì)照組中多糖含量。

3.3 抗氧化試驗(yàn)

對(duì)蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖、蛹蟲(chóng)草精多糖和對(duì)照組多糖分別進(jìn)行總還原力和羥自由基清除率的測(cè)定，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3、圖4結(jié)果表明，三者的總還原力依次為蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖>蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)精多糖>對(duì)照組；三者的羥自由基清除率依次為蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖>蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)精多糖>對(duì)照組。

3.4 不同濃度時(shí)蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖羥自由基清除率比較

蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖對(duì)羥自由基有良好的清除效果，其結(jié)果見(jiàn)圖5。

本實(shí)驗(yàn)體系中，羥自由基清除效果與多糖質(zhì)量濃度相關(guān)性很高，當(dāng)蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖質(zhì)量濃度上升到30 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到84.4%。

4 討論

本研究結(jié)果表明，蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌絲中多糖的洗脫峰值明顯高于對(duì)照組多糖，兩者洗脫時(shí)間不同表明兩者多糖的結(jié)構(gòu)不同。蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌絲中多糖含量大于對(duì)照組多糖含量。蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖的總還原力及羥自由基清除率均優(yōu)于蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)精多糖，這表明蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)中多糖種類(lèi)繁雜，并非單一多糖，其中含有多種具有抗氧化功能的多糖，且多糖之間的抗氧化功能可能存在協(xié)同作用，故對(duì)其進(jìn)行純化并不利于其更好地發(fā)揮抗氧化功能。

蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)粗多糖羥自由基清除率最高可達(dá)84.4%。孟兆麗等[18]報(bào)道的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體提取蛹蟲(chóng)草多糖CM-40、CM-60及CM-80羥自由基清除率分別為60.8%、71.1%和85.7%；曲瑾郁等[19]報(bào)道的蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)子實(shí)體提取蟲(chóng)草多糖羥自由基清除率為81.14%，硫酸化修飾后的蛹蟲(chóng)草多糖羥自由基清除率78.66%，乙?；揎椇蟮南x(chóng)草多糖羥自由基清除率84.26%，羧甲基化修飾后的蟲(chóng)草多糖羥自由基清除率為57.9%；張杰等[20]報(bào)道蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)子實(shí)體提取的蟲(chóng)草胞內(nèi)多糖羥自由基清除率最高可達(dá)100%。同以上報(bào)道相比，本實(shí)驗(yàn)所用蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)所獲得的蛹蟲(chóng)草多糖的抗氧化性較強(qiáng)，蛹蟲(chóng)草3號(hào)粗多糖總還原力為0.182。曲瑾郁[19]等報(bào)道蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)子實(shí)體提取的蛹蟲(chóng)草多糖總還原力為0.049，硫酸化修飾后的蛹蟲(chóng)草多糖總還原力為0.054，乙酰化修飾后的蛹蟲(chóng)草多糖總還原力為0.069，羧甲基化修飾后的蛹蟲(chóng)草多糖總還原力為0.088，同以上報(bào)道相比，本實(shí)驗(yàn)使用蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)所獲得的蛹蟲(chóng)草多糖還原力最強(qiáng)，同時(shí)本研究結(jié)果還為該蛹蟲(chóng)草新菌株3號(hào)菌株在醫(yī)療保健領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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The Extraction and Anti-oxidation Activity of Polysaccharide from a New Strain ofCordycepsmilitaris

WANG Duo1, LI Ning-xin1, LIU Gui-yu1, DONG Su-rong2, CHAI Hui-xia1

(1.Hebei Normal University, ShijiazhuangHebei050024; 2.Hebei Women’s Vocational College, ShijiazhuangHebei050091)

The polysaccharide preparations were obtained from culturedCordycepsmilitarisnew strain(No.3). The total reducing power and hydroxy radical scavenging capacity of the crude polysaccharides and the refined polysaccharides fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) were determined and compared. The hydroxy radical scavenging capacity of crude polysaccharides fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) at different doses were also determined. The results showed that the total reducing power of crude polysaccharides fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) was 0.182 and hydroxy radical scavenging capacity was 84.4%. The hydroxy radical scavenging capacity increased with the increasing concentration of crude polysaccharides. The total reducing power of refined polysaccharide fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) was 0.136 and hydroxy radical scavenging capacity was 55.3%. The total reducing power and hydroxy radical scavenging capacity of the crude polysaccharides were stronger than the refined polysaccharides. The results above indicated that several polysaccharides with antioxidant function existed in the new strain ofCordycepsmilitarisnew strain(No.3) and these polysaccharides acted synergistically.

New strain ofCordycepsmilitaris(No.3); Polysaccharide extraction; Antioxidant property

*項(xiàng)目來(lái)源：河北省自然科學(xué)基金“蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)小鼠盆腔炎抑菌效果的研究”(C2011205111)。

王多(1980-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事生態(tài)學(xué)相關(guān)研究。

**通信作者：柴惠霞(1958-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦科學(xué)方向研究。E-mail: chxwjb@163.com

2014-09-25

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0056-03