王 多，李寧馨，劉桂宇，董素蓉，柴惠霞**

(1.河北師范大學(xué)，河北 石家莊 050024；2.河北女子職業(yè)學(xué)院，河北 石家莊 050091)

蛹蟲草新菌株3號多糖提取及其抗氧化作用*

王 多1，李寧馨1，劉桂宇1，董素蓉2，柴惠霞1**

(1.河北師范大學(xué)，河北 石家莊 050024；2.河北女子職業(yè)學(xué)院，河北 石家莊 050091)

對蛹蟲草新菌株3號多糖進(jìn)行提取純化，通過體外氧化反應(yīng)體系評價蛹蟲草新菌株3號粗多糖及精多糖總還原力、羥自由基清除能力及不同濃度時蛹蟲草新菌株3號粗多糖羥自由基清除能力。結(jié)果表明，蛹蟲草粗多糖總還原力為0.182，羥自由基清除率為84.4%，且隨多糖濃度上升，羥自由基清除率增大。蛹蟲草新菌株3號精多糖總還原力為0.136，羥自由基清除率為55.3%。蛹蟲草新菌株3號粗多糖總還原力、羥自由基清除率均優(yōu)于蛹蟲草新菌株3號精多糖。由此推斷蛹蟲草新菌株3號中多糖種類繁雜，并非單一多糖，其中含有多種抗氧化功能的多糖，且多糖之間的抗氧化功能可能存在協(xié)同作用。

蛹蟲草新菌株3號；多糖提取；抗氧化

蛹蟲草新菌株3號(Cordycepsmilitaris)是真菌門(Eumycota)、子囊菌亞門(Ascomycotina)、麥角菌目(Clavicipitales)、麥角菌科(Clavicepitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)的模式種，俗名又稱蟲草花、北蛹蟲草新菌株3號、北冬蟲夏草等，是1種珍貴的食藥兼用的真菌[1，2]。蛹蟲草的有效成分和藥效與天然冬蟲夏草高度相似，在藥化、藥理和臨床實(shí)驗(yàn)中被證明可作為冬蟲夏草的重要人工替代品[3，4]。近年來，隨著蛹蟲草新菌株3號藥用保健等功能的不斷應(yīng)用和人工繁殖技術(shù)日趨成熟，市場上存在大量人工培育的蛹蟲草新菌株3號，但質(zhì)量差距較大[5]。不同蛹蟲草新菌株3號菌株的蟲草多糖含量不同，并且同一菌株因?yàn)榕囵B(yǎng)基等因素的差異，也會導(dǎo)致多糖含量的變化[6]。蟲草多糖是蛹蟲草新菌株3號中含量最高的藥理活性物質(zhì)，具有良好的抗鹽性、增稠性、觸變性、耐熱性等[7，8]，可調(diào)節(jié)人體免疫功能，且在抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖、抑菌、改善肝功能等方面均有顯著功效[9-15]。

本研究以石家莊創(chuàng)新食用菌研究所提供的蛹蟲草新菌株3號菌絲為實(shí)驗(yàn)材料，分析了菌絲多糖含量、羥自由基清除率、總還原力以及粗多糖不同濃度時對羥自由基清除率，進(jìn)一步篩選多糖產(chǎn)量高、抗氧化活性好的蛹蟲草新菌株3號提供依據(jù)，為蛹蟲草新菌株3號保健品在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 樣品來源

以小麥為培養(yǎng)基的蛹蟲草新菌株3號菌絲(石家莊創(chuàng)新菌類研究所提供)，將樣品干燥后研磨成粉末待測。

1.2 儀器與試劑

uv-5分光光度計(jì)、立式搖床等。濃硫酸、重蒸苯酚、葡萄糖等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蛹蟲草新菌株3號多糖的提取、分離和純化

2.1.1 提取工藝

以烘干的蛹蟲草新菌株3號菌絲為實(shí)驗(yàn)組，以烘干的小麥培養(yǎng)基為對照組，分別粉碎后用無水乙醇提取6 h以除去單糖和脂溶性成分，烘干。殘?jiān)?0℃條件下用水提取3次，過濾，濾液減壓濃縮，加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，離心，得沉淀。沉淀溶于水，Savage法除去蛋白質(zhì)，再用50%乙醇沉淀，冷凍干燥后獲得蛹蟲草新菌株3號菌絲粗多糖和對照組多糖[16]。

2.1.2 凝膠過濾法分離純化

Sephadex G-75置直徑為3 cm的層析柱，0.1 mol·L-1的NaCl溶液平衡。洗脫液流速0.5 mL·min-1，將實(shí)驗(yàn)組樣品溶解于1 mL水中，過柱；部分收集器收集洗脫液50管，每管3 mL；定量取各管收集液0.2 mL，苯酚硫酸法測含量，分光光度計(jì)490 nm處測OD值。

2.2 多糖含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取干燥至恒重的葡萄糖50 mg，置于 1 000 mL 量瓶中，配成50 μg·mL-1濃度的葡萄糖溶液。取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于試管中，加水至2 mL。加入0.5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入硫酸5 mL，搖勻后放置10 min。置25℃水浴中15 min，取出冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算葡萄糖含量C與吸光值A(chǔ)的回歸方程：A= 4.3085C+ 0.2307，R2=0.9992。

2.2.2 待測品測定

精密量取供試液，按 2.2.1 方法操作，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

2.3 抗氧化分析

2.3.1 總還原力測定

具塞試管中加樣品、磷酸鈉緩沖溶液及1%K3[Fe(CN)6]，置于50℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，再加入10%C2HCl3O2溶液，取反應(yīng)液1.5 mL，加3.0 mL水和0.2 mL1% FeCl3溶液，混合均勻，5 min后于波長700 nm處測定其吸光值[17]。

2.3.2 羥自由基清除能力測定

利用 Fenton反應(yīng)測定蟲草多糖對亞鐵離子催化過氧化氫產(chǎn)生的羥自由基清除能力[18]。反應(yīng)體系含有H2O21 mL、FeSO41 mL、水楊酸-乙醇1 mL、3種多糖溶液(濃度 30mg·mL-1)1 mL。最后加H2O2啟動反應(yīng)，以蒸餾水作為參比，在波長510 nm處測定各濃度的吸光度值。每個濃度重復(fù)3次，取吸光度值的平均值?！H清除率的計(jì)算公式為：

P=[A0-(AX-AX0)]A0×100%

式中：A0為空白對照液吸光度值，只加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過氧化氫，不加入蟲草多糖溶液的吸光度值；AX為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過氧化氫、蟲草多糖的吸光度值；AX0為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、蟲草多糖溶液，不加過氧化氫引發(fā)反應(yīng)的吸光度值。

2.3.3 不同濃度的蛹蟲草新菌株3號粗多糖羥自由基清除率的比較

利用Fenton反應(yīng)測定蛹蟲草多糖對羥自由基的清除能力。將蛹蟲草新菌株3號精多糖精確配制為濃度30 mg·mL-1，用蒸餾水將該溶液稀釋為6種濃度：5 mg·mL-1、10 mg·mL-1、15 mg·mL-1、20 mg·mL-1、25 mg·mL-1、30 mg·mL-1，其余按2.3.2方法操作于波長510 nm處測吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 凝膠色譜法洗脫曲線

以NaCl溶液對蛹蟲草新菌株3號粗多糖和對照組分別進(jìn)行洗脫，前者洗脫曲線如圖1所示，后者脫曲線如圖2所示。

圖1、圖2對比得知，蛹蟲草新菌株3號粗多糖吸光度峰值較對照組高數(shù)倍，且前者多糖集中于10管～14管，后者多糖集中于9管～14管。收集蛹蟲草新菌株3號粗多糖峰面積最大洗脫峰，脫鹽，濃縮后分別得到蛹蟲草新菌株3號小麥精多糖。

3.2 多糖含量測定

蛹蟲草新菌株3號菌絲多糖、對照組多糖含量情況見表1。

表1 蛹蟲草新菌株3號菌絲和對照組多糖含量

注：表中數(shù)據(jù)為均值±SD；同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母分別表示差異顯著(p<0.05，t-test)。

由表1可見，蛹蟲草新菌株3號菌絲中多糖含量大于對照組中多糖含量。

3.3 抗氧化試驗(yàn)

對蛹蟲草新菌株3號粗多糖、蛹蟲草精多糖和對照組多糖分別進(jìn)行總還原力和羥自由基清除率的測定，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3、圖4結(jié)果表明，三者的總還原力依次為蛹蟲草新菌株3號粗多糖>蛹蟲草新菌株3號精多糖>對照組；三者的羥自由基清除率依次為蛹蟲草新菌株3號粗多糖>蛹蟲草新菌株3號精多糖>對照組。

3.4 不同濃度時蛹蟲草新菌株3號粗多糖羥自由基清除率比較

蛹蟲草新菌株3號粗多糖對羥自由基有良好的清除效果，其結(jié)果見圖5。

本實(shí)驗(yàn)體系中，羥自由基清除效果與多糖質(zhì)量濃度相關(guān)性很高，當(dāng)蛹蟲草新菌株3號粗多糖質(zhì)量濃度上升到30 mg·mL-1時，清除率達(dá)到84.4%。

4 討論

本研究結(jié)果表明，蛹蟲草新菌株3號菌絲中多糖的洗脫峰值明顯高于對照組多糖，兩者洗脫時間不同表明兩者多糖的結(jié)構(gòu)不同。蛹蟲草新菌株3號菌絲中多糖含量大于對照組多糖含量。蛹蟲草新菌株3號粗多糖的總還原力及羥自由基清除率均優(yōu)于蛹蟲草新菌株3號精多糖，這表明蛹蟲草新菌株3號中多糖種類繁雜，并非單一多糖，其中含有多種具有抗氧化功能的多糖，且多糖之間的抗氧化功能可能存在協(xié)同作用，故對其進(jìn)行純化并不利于其更好地發(fā)揮抗氧化功能。

蛹蟲草新菌株3號粗多糖羥自由基清除率最高可達(dá)84.4%。孟兆麗等[18]報(bào)道的蛹蟲草子實(shí)體提取蛹蟲草多糖CM-40、CM-60及CM-80羥自由基清除率分別為60.8%、71.1%和85.7%；曲瑾郁等[19]報(bào)道的蛹蟲草新菌株3號子實(shí)體提取蟲草多糖羥自由基清除率為81.14%，硫酸化修飾后的蛹蟲草多糖羥自由基清除率78.66%，乙?；揎椇蟮南x草多糖羥自由基清除率84.26%，羧甲基化修飾后的蟲草多糖羥自由基清除率為57.9%；張杰等[20]報(bào)道蛹蟲草新菌株3號子實(shí)體提取的蟲草胞內(nèi)多糖羥自由基清除率最高可達(dá)100%。同以上報(bào)道相比，本實(shí)驗(yàn)所用蛹蟲草新菌株3號所獲得的蛹蟲草多糖的抗氧化性較強(qiáng)，蛹蟲草3號粗多糖總還原力為0.182。曲瑾郁[19]等報(bào)道蛹蟲草新菌株3號子實(shí)體提取的蛹蟲草多糖總還原力為0.049，硫酸化修飾后的蛹蟲草多糖總還原力為0.054，乙酰化修飾后的蛹蟲草多糖總還原力為0.069，羧甲基化修飾后的蛹蟲草多糖總還原力為0.088，同以上報(bào)道相比，本實(shí)驗(yàn)使用蛹蟲草新菌株3號所獲得的蛹蟲草多糖還原力最強(qiáng)，同時本研究結(jié)果還為該蛹蟲草新菌株3號菌株在醫(yī)療保健領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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The Extraction and Anti-oxidation Activity of Polysaccharide from a New Strain ofCordycepsmilitaris

WANG Duo1, LI Ning-xin1, LIU Gui-yu1, DONG Su-rong2, CHAI Hui-xia1

(1.Hebei Normal University, ShijiazhuangHebei050024; 2.Hebei Women’s Vocational College, ShijiazhuangHebei050091)

The polysaccharide preparations were obtained from culturedCordycepsmilitarisnew strain(No.3). The total reducing power and hydroxy radical scavenging capacity of the crude polysaccharides and the refined polysaccharides fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) were determined and compared. The hydroxy radical scavenging capacity of crude polysaccharides fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) at different doses were also determined. The results showed that the total reducing power of crude polysaccharides fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) was 0.182 and hydroxy radical scavenging capacity was 84.4%. The hydroxy radical scavenging capacity increased with the increasing concentration of crude polysaccharides. The total reducing power of refined polysaccharide fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) was 0.136 and hydroxy radical scavenging capacity was 55.3%. The total reducing power and hydroxy radical scavenging capacity of the crude polysaccharides were stronger than the refined polysaccharides. The results above indicated that several polysaccharides with antioxidant function existed in the new strain ofCordycepsmilitarisnew strain(No.3) and these polysaccharides acted synergistically.

New strain ofCordycepsmilitaris(No.3); Polysaccharide extraction; Antioxidant property

*項(xiàng)目來源：河北省自然科學(xué)基金“蛹蟲草多糖對小鼠盆腔炎抑菌效果的研究”(C2011205111)。

王多(1980-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事生態(tài)學(xué)相關(guān)研究。

**通信作者：柴惠霞(1958-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦科學(xué)方向研究。E-mail: chxwjb@163.com

2014-09-25

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0056-03