李 曉，孟秀秀，代月婷，黎 倩，黃 兵，胡 欣

(吉林農業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

〈育種與馴化〉

黑木耳簡單快速組織分離新法*

李 曉，孟秀秀，代月婷，黎 倩，黃 兵，胡 欣

(吉林農業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

利用酒精、鑷子對黑木耳耳片進行組織分離，方法方便、快捷，分離成功率100%。

黑木耳；干耳片；組織分離

從早期的耳木分離法、孢子彈射分離法培育菌種發(fā)展到后來的利用鮮木耳或干耳片分離法[1]培育菌種，木耳菌種的選育工作一直比較繁瑣且分離成活率不高。為突破這一難關，筆者經實踐，探索出了1種木耳干耳組織分離新技術。此法不僅目標明確、盲目性低，而且兼具取材簡單、操作便捷、成活率高等諸多優(yōu)勢。經此法分離培育的菌株菌絲萌發(fā)迅速，生長旺盛，濃白粗壯。

1 材料與方法

1.1 分離材料

挑選少筋、無褶皺或少褶皺、無霉、無蟲害、6分～8分成熟度的吉Au01單片為實驗材料。

1.2 分離工具

鑷子、酒精燈、打火機、90 mm培養(yǎng)皿(4個)、75%消毒酒精棉、超凈工作臺。

1.3 分離培養(yǎng)基

采用常規(guī)PDA培養(yǎng)基。其配方為馬鈴薯(去皮，無芽)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g～18 g(或瓊脂條20 g)，水 1 000 mL。培養(yǎng)基在121℃下滅菌30 min后，待溫度降至55℃～60℃時出鍋擺斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.4 滅菌試劑

將4個培養(yǎng)皿依次編號為1、2、3、4，并分別對4個培養(yǎng)皿按表1進行處理。

表1 滅菌試劑處理

1.5 分離與培養(yǎng)

1.5.1 組織分離

首先，紫外線滅菌。將PDA試管培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等用具放置于超凈工作臺上，紫外線下滅菌30 min，以殺死大部分雜菌。

然后用75%的酒精棉球擦拭雙手及鑷子。用鑷子將耳片內卷的邊緣部分去掉。在耳片上光滑無褶皺的地方夾取約3 mm2(芝麻粒大小)的耳片20塊放入1號培養(yǎng)皿中，再同樣夾取20塊放入3號培養(yǎng)皿中浸泡滅菌。1 min后，用鑷子將1號培養(yǎng)皿中的耳片夾入2號培養(yǎng)皿中，3號中的耳片夾入4號中再次浸泡1 min。

最后用滅菌冷卻后的鑷子夾取耳片從酒精燈火焰上快速穿梭1 s(穿梭時間不宜過長，否則容易燒死耳片)后放入PDA培養(yǎng)基上，蓋上膠塞。

1.5.2 分離培養(yǎng)

將分離后的試管置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.5.3 純化培養(yǎng)

分離培養(yǎng)6 d后，挑取生長整齊的前端菌絲塊作為接種塊接種到PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。

2 結果與分析

組織分離培養(yǎng)2 d后菌絲開始萌發(fā)，可看到白色絨毛狀菌絲，定期觀察污染和菌絲生長情況，菌絲生長整齊、濃白粗壯，符合正常黑木耳菌種特征，分離成功率達100%。結果見表2。

表2 黑木耳組織分離培養(yǎng)記錄

注：分離成功率指每個耳片能分離出純黑木耳培養(yǎng)物的幾率。

從表2可以看出，2種方法都能分離出黑木耳，但A方法成活率稍低一點，為25%，且污染中幾乎都是細菌污染，B方法基本無污染，既沒有細菌污染也沒有霉菌污染。這說明75%酒精對霉菌殺菌效果非常好，能殺死耳片上幾乎所有的霉菌，但對細菌的殺菌效果不是非常理想，加入青霉素、鏈霉素后幾乎能夠殺死全部的細菌。

A方法培養(yǎng)2 d～3 d后菌絲開始萌發(fā)。B方法接種后1 d～2 d菌絲全部萌發(fā)，并且菌絲潔白粗壯，說明青霉素、鏈霉素對木耳菌絲不但沒有抑制作用，相反還有促進作用，但促進作用的程度還有待進一步研究。

3 小結與討論

現有的很多木耳菌種的分離方法仍存在許多的不足：如用鮮木耳直接分離或用水潤濕后再分離操作繁瑣、成活率低；而用氯化汞浸泡分離[2]處理，由于氯化汞有劇毒，對周圍環(huán)境及木耳菌種都有很大程度的危害，且用氯化汞消毒后需在無菌水中多次沖洗，相當繁瑣復雜。

本方法與傳統(tǒng)的木耳分離法[1，2]相比，設備簡約，成本低廉，操作快速簡便，污染率極低(將耳片放入添加了青霉素、鏈霉素、酒精的溶液中浸泡2個1 min就能迅速徹底滅菌)，克服了膠質菌類組織層較薄、具有一定韌性、不易分離的特點[3]。適用于野生及栽培的多種膠質菌類的菌種分離選育開辟了一條組織分離的新途徑，為廣大科研工作者及生產者提供了便利。

通過A、B兩組對比實驗，筆者認為青霉素、鏈霉素具有極好的抑制細菌生長效果。除將青霉素和鏈霉素加入到酒精中之外，還可以添加到培養(yǎng)基中[4]。關于青霉素和鏈霉素用量及浸泡時間等問題還有待進一步研究和探討。

[1]杜萍，崔寶凱. 木耳菌種分離新方法簡介[J].浙江食用菌，2009(6)：27-28.

[2]李云龍，劉柱. 黑木耳的組織分離技術[J].浙江食用菌，2008，16(3)：27.

[3]黃毅.食用菌栽培[M].北京：高等教育出版社，2008.

[4]李曉，劉振欽，劉曉龍，等. 大型經濟真菌單孢分離方法的研究[J].吉林農業(yè)大學學報，2002，24(3)：41-42.

One Simple and Fast Method onAuriculariaauriculaTissue Isolation

LI Xiao, MENG Xiu-xiu, DAI Yue-ting, LI Qian, HUANG Bing, HU Xin

(Jilin Agricultural University Engineering Research Center of Edible and Medicinal Fungi, Ministry of Education, ChangchunJilin130118)

Ethanol and forceps were used to isolateAuriculariaauriculadry fruit body for tissue culture quickly and conveniently, and the successful rate can go up to 100%.

Auriculariaauricula; Dry fruit body; Tissue isolation

*項目來源：國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系“北方野生菌收集保育與馴化”(GARS-24)；吉林省重大項目“作物秸稈與畜禽糞便高效轉化生產食用菌的關鍵技術研究與示范”(10ZDGG003)。

李曉(1976-)，男，副教授，從事食用菌教學、科研和產業(yè)化開發(fā)等研究工作。

2014-09-18

S646.6

A

1003-8310(2014)06-0011-02