杜紅陽 李東寧 付海燕 包翠芬 秦書儉

Notch1(NICD)過表達真核載體構建及對大鼠BMSCs增殖分化的影響

杜紅陽1李東寧1付海燕2△包翠芬3秦書儉3

目的 探討過表達Notch1(NICD)基因?qū)Υ笫蠊撬栝g充質(zhì)干細胞（BMSCs）增殖分化的影響。方法構建Notch1(NICD)過表達真核載體，實驗分正常對照組（CON組，不做轉染）、陽性對照組（空載體組，將質(zhì)粒pEGFP-N1轉染BMSCs）和轉染組（將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NICD轉染BMSCs）。轉染48 h后觀察細胞一般狀態(tài)，Real-time PCR和Western blotting檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和Notch1基因和蛋白表達，流式檢測轉染后細胞凋亡、細胞周期，MTT檢測細胞增殖情況。結果重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NICD編碼序列與設計完全一致。轉染組和空載體組BMSCs均可表達綠色熒光。轉染組GFAP、Notch1的基因和蛋白表達均高于CON組和空載體組（均P＜0.05），空載體組與CON組差異無統(tǒng)計學意義；各組間NSE的基因和蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。轉染組存活細胞比率低于CON組和空載體組，早期細胞凋亡比率、晚期細胞凋亡比率均高于CON組和空載體組；空載體組晚期細胞凋亡比率高于CON組。轉染組細胞處于G1/G0期的比例高于CON組和空載體組，處于S期和G2/M期的比例低于CON組和空載體組（均P＜0.05）。除轉染1 d時各組MTT A490值差異無統(tǒng)計學意義外，其余時點轉染組MTT A490值均低于CON組和空載體組（均P＜0.05）。結論高表達Notch1(NICD)基因可能在一定程度上誘導BMSCs凋亡、抑制其增殖，且表現(xiàn)誘導向神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞分化。

細胞增殖；細胞分化；轉染；神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)；磷酸丙酮酸水合酶；Notch信號通路；骨髓間充質(zhì)干細胞；誘導；Notch1(NICD)

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenehymal stem cells,BMSCs）是一類來源于骨髓的非造血干細胞，目前BMSCs在皮膚病包括皮膚傷口愈合、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、放射性皮炎和硬皮病等方面的治療作用受到廣泛的關注[1]。近年來關于BMSCs增殖分化的分子機制的研究多集中在細胞信號通路上[2]。其中，Notch信號通路是一條保守而非常重要的細胞信號通路[3]。Notch信號通路由受體、配體、下游信號傳遞分子及調(diào)節(jié)分子等組成[4]，在哺乳動物中,目前已發(fā)現(xiàn)4種Notch受體（Notch1～4），5種配體（Delta 1，3，4和Jagged 1，2），其中Notch1為細胞表面跨膜蛋白，NICD（the intracellular domain of Notch）為其胞內(nèi)段且發(fā)揮重要的信號傳遞作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)正常擴增的BMSCs其Notch1蛋白為相對高表達，在促分化劑作用下Notch1 （NICD）蛋白表達降低[5]，而本研究旨在探討過表達Notch1(NICD)基因?qū)MSCs增殖分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 Notch1兔抗大鼠單克隆抗體購自Cell signaling公司，NICD一抗購自美國SANTA CRUZ公司，Hoechst33258購自Sigma公司，SDS購自Biomol公司，NheⅠ、AgeⅠ內(nèi)切酶購自NEB公司；AxyPrep凝膠回收試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Axygen公司；Wide Range DNA Marker、RNA PCR kit(AMV)Ver 3.0、PMD18-T載體XGal、IPTG、T4DNA連接酶和大腸桿菌DH5α及克隆載體pMD18-T Vector、真核表達載體pEGFP-N1均購自TaKaRa公司；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉染試劑盒購自Invitrogen公司。Triton X-100購自美國Amresco公司，TRITC標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗細胞 純化P5大鼠BMSCs由遼寧醫(yī)學院科學實驗中心提供，經(jīng)細胞凍存復蘇后進行傳代培養(yǎng)。當細胞生長融合達培養(yǎng)板/孔85％時應用0.25％胰蛋白酶及0.02％ EDTA混合消化液消化，1∶3比例轉入培養(yǎng)瓶內(nèi)傳代。取P3～P5代細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板或以5× 106個/mL接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.1.3 儀器 EC250電泳儀（美國EC公司），細胞超聲粉碎儀VCX105（美國BIO-RAD公司）；數(shù)控層析冷柜SL-Ⅲ（上海新諾）；熒光分光光度計（天津拓普）。PCR儀（美國ABI公司），實時熒光定量PCR儀、核酸蛋白定量儀（德國Eppendorf公司）；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Syngene公司）；倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡IX70（日本Olympus公司），凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國Kodak公司）等。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及質(zhì)粒構建 根據(jù)GenBank大鼠Notch1 cDNA序列號X57405，采用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設計并擴增Notch1胞內(nèi)段（NICD）編碼區(qū)的引物。并且在上游引物的5′端引入NheⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點，在下游引物5′端引入AgeⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點，引物序列如下：Notch1-F 5′-AGTCGCTAGCATGGTGCTGCTGTCCCGCAAGCGCA-3′；Notch1-R 5′-GTACCGGTGGCTTAAATGCCTCTGGAATGTGGGTG-3′，下劃線部分為酶切識別位點。經(jīng)Blast分析所選序列與大鼠其他基因序列無同源性。經(jīng)PCR擴增酶切與載體質(zhì)粒連接，見圖1，質(zhì)粒提取試劑盒提取連接好的質(zhì)粒，送上海生工生物工程有限公司測序。測序正確后將構建的重組表達質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-NICD，保存于-20℃冰箱中，用于后續(xù)試驗。

Fig.1 The pEGFP-N1 carrier vector and multiple clone site icon (MCS means multiple clone site)圖1 pEGFP-N1載體質(zhì)粒及多克隆位點圖譜（MCS為多克隆位點）

1.2.2 細胞轉染及實驗分組 采用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提pEGFP-N1-NICD和pEGFP-N1，經(jīng)蛋白核酸分光光度計和電泳檢測，A260/A280在1.8～2.0，且無任何降解的質(zhì)粒DNA用于轉染（pEGFP-N1-NICD濃度為200 mg/L，pEGFPN1濃度為200 mg/L）。實驗分組：正常對照組（CON組）：不做轉染的BMSCs；陽性對照組（空載體組）：將質(zhì)粒pEGFP-N1轉染BMSCs；轉染組：將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NICD轉染BMSCs。使用6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞，將每板細胞分為3組，每組2孔。參照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉染試劑盒說明，將質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉染法導入各組純化培養(yǎng)的BMSCs。確保種植于6孔板中的BMSCs生長超過80％；用無血清培養(yǎng)基DMEM來稀釋Lipofectamine 2000和質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)的混合比例1∶3，將轉染細胞置于37℃的5％CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，此時為瞬時表達，每組收集2孔標本用于后續(xù)檢測。

1.2.3 轉染后一般形態(tài)學觀察 轉染后每日倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化。轉染48 h后計算轉染效率，隨機讀取3個非重疊高倍視野，計數(shù)發(fā)綠色熒光的細胞占所有細胞中的百分比，并計算平均值。

1.2.4 Real-time PCR檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和Notch1基因表達 細胞總RNA的提取，按照Invitrogen公司的TRIzol Reagent使用說明書進行操作，然后進行總RNA的純度測定和質(zhì)量檢測，制備反轉錄cDNA按照TaKaRa公司Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser說明書操作進行。最終進行Realtime PCR反應，Realtime PCR引物由TaKaRa公司設計合成，引物序列如下：NSE基因上游5′-CAACAGCACCATCGCACCG-3′,下游5′-GGCAAAGCCGCCTTCATC-3′;GFAP基因上游5′-GATGTAGGAGTGGGTAGGGC-3′,下游5′-GGACTGAGCAACCAGGAATAG-3′;Notch1基因上游5′-GCCGCAAGAGGCTTGAGAT-3′,下游5′-GGGGTCCTGGCATCGCTGG-3′；內(nèi)參GAPDH基因上游5′-CCCACGGCAAGTTCAACGGCA-3′,下游5′-TGGCAGGTTTCTCCAGGCGGC-3′，利用Eppendorf公司的Realplex實時定量PCR儀進行分析，GAPDH作內(nèi)參對每個基因進行標準化，每個樣品同一個基因重復3次，并用去離子水取代模板作為陰性對照。反應完成后，系統(tǒng)軟件將自動計算出每個樣本擴增的Threshold cycle(Ct)值，最終根據(jù)目的基因和管家基因的Ct值，計算出目的基因的相對表達量，用2-△△Ct表示。對照組各基因表達量設為1。

1.2.5 Western blotting檢測NSE、GFAP和NICD蛋白表達情況 收集轉染48 h后細胞，棄培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗3遍，Western blotting法檢測蛋白表達，蛋白條帶圖像經(jīng)過凝膠成像照相及圖像分析系統(tǒng)測定其光密度，每個樣本重復3次，計算各個樣本積分光密度（條帶強度×條帶面積）與β-actin內(nèi)參對照的比值（IOD值），即相對IOD值，以表示目標蛋白的相對表達量，從而反映各目的蛋白水平的變化情況。

1.2.6 轉染后BMSCs細胞凋亡和細胞周期檢測 轉染48 h后各組細胞，按照Calbiochem?Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（購自美國EMD化學試劑公司）說明書操作用流式細胞儀檢測細胞凋亡。同時收集轉染后各組細胞，加預冷70％乙醇固定，4℃，加PI 37℃避光30 min，檢測細胞周期，每組實驗重復3次。

1.2.7 MTT檢測轉染后BMSCs增殖情況 轉染前1 d，BMSCs 以1×104個/孔接種于96孔板中，按上述分組進行實驗，每組設7個復孔。轉染48 h后，加入完全培養(yǎng)基，從第2天起每隔24 h（分別為第1、2、3、4天）取7孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，37℃繼續(xù)孵育3 h后終止培養(yǎng)。小心棄除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩15 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度值（OD值），計算不同組別細胞活力，整個過程重復3次，取其均值，繪制細胞增殖曲線。

1.3 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)均采用±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Notch1過表達真核質(zhì)粒鑒定 測序結果見圖2，重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NICD編碼序列與設計完全一致。

2.2 Notch1（NICD）基因轉染后BMSCs形態(tài)學觀察及檢測

2.2.1 基因轉染后BMSCs一般形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下觀察，P3～P5代大鼠BMSCs形態(tài)均一，呈紡錘形、長梭形為主。Notch1（NICD）基因轉染6 h后，細胞形態(tài)無顯著改變，24 h后少部分細胞胞漿向核略回縮，出現(xiàn)胞體伸出多數(shù)突起，分支數(shù)量逐漸增加，似神經(jīng)樣細胞形態(tài)改變。24～48 h神經(jīng)樣細胞數(shù)量逐漸增多，但轉染48 h后出現(xiàn)部分細胞死亡現(xiàn)象，隨著培養(yǎng)時間的延長，死亡細胞不再增加，而后穩(wěn)定生長。至5 d神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞不斷增多，但至7 d時因轉染細胞老化，而出現(xiàn)不斷死亡。CON組和空載體組細胞胞體較前略有收縮，2組均未見神經(jīng)樣細胞的出現(xiàn)。熒光顯微鏡觀察，轉染48 h后轉染組和空載體組的BMSCs均可以表達綠色熒光，且表達的部位無差異，轉染細胞的胞漿和細胞核中均有特異性綠色熒光蛋白的表達。CON組BMSCs沒有熒光表達，見圖3。轉染48 h后，轉染組轉染效率可達到60％。

Fig.2 The gene sequencing results of pEGFP-N1-NICD eukaryotic expression vector圖2 pEGFP-N1-NICD真核表達載體的基因測序結果

Fig.3 The cell morphology after 48-hour transfection(×200)圖3 轉染48 h各組細胞形態(tài)(×200）

2.2.2 各組NES、GFAP、Notch1 mRNA表達情況比較 各組細胞提取總RNA的OD260/OD280比值均位于1.8～2.0，無蛋白質(zhì)和DNA污染；熔解曲線分析顯示各目的基因熔解曲線高尖，無其他基因非特異性擴增的波峰，說明實驗選擇的引物合適，無不擴增現(xiàn)象。轉染48 h后，轉染組GFAP、Notch1基因相對表達量均明顯高于CON組和空載體組（均P＜0.05），而各組間NSE基因表達差異無統(tǒng)計學意義。空載體組與CON組間各基因表達差異均無統(tǒng)計學意義，見圖4。

2.2.3 各組NSE、GFAP和Notch1（NICD）蛋白表達情況比較 轉染組GFAP、Notch1（NICD）蛋白表達均高于CON組和空載體組（均P＜0.05），空載體組與CON組間GFAP、Notch1（NICD）蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義。各組間NSE蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖5、6。

Fig.4 The NES,GFAP and Notch1 mRNA expressions detected by real-time PCR圖4 Real-time PCR檢測NES、GFAP、Notch1 mRNA表達情況

Fig.5 The protein expressions of NSE,GFAP and NICD in three groups圖5 3組NSE、GFAP和NICD蛋白表達

Fig.6 Comparison of IOD values of NSE,GFAP and NICD between three groups圖6 3組NSE、GFAP和Notch1（NICD）蛋白IOD值比較

2.2.4 基因轉染后BMSCs細胞凋亡和細胞周期變化情況 BMSCs轉染48 h后，轉染組存活細胞比率低于CON組和空載體組，早期細胞凋亡比率、晚期細胞凋亡比率均高于CON組和空載體組（均P＜0.05）；空載體組晚期細胞凋亡比率高于CON組（P＜0.05），見圖7、表1。轉染組細胞處于G1/G0期的比例明顯高于CON組和空載體組，而處于S期和G2/M期的比例明顯低于CON組和空載體組（均P＜0.05），見表2。

Fig.7 The apoptosis scatter diagram of BMSCs after transfection in three groups圖7 基因轉染后3組BMSCs細胞凋亡散點圖

Tab.1 Comparison of the cell apoptosis after transfection between three groups表1 基因轉染后3組細胞凋亡情況比較（n=3，％，±s）

Tab.1 Comparison of the cell apoptosis after transfection between three groups表1 基因轉染后3組細胞凋亡情況比較（n=3，％，±s）

＊P＜0.05,；a與CON組比較，b與空載體組比較，P＜0.05

組別CON組空載體組轉染組F晚期細胞凋亡比率4.75±1.08 9.64±2.33a13.96±2.38ab385.27＊存活細胞比率89.09±0.13 83.25±2.07 71.77±0.89ab57.18＊早期細胞凋亡比率5.21±0.97 6.09±1.43 11.26±1.70ab189.14＊

Tab.2 Comparison of the cell cycles after transfection between three groups表2 基因轉染后3組細胞周期情況比較（n=3，％，±s）

Tab.2 Comparison of the cell cycles after transfection between three groups表2 基因轉染后3組細胞周期情況比較（n=3，％，±s）

＊P＜0.05,；a與CON組比較，b與空載體組比較，P＜0.05

組別CON組空載體組轉染組F G1/G0 62.11±0.01 63.25±0.15 81.56±1.23ab43.26＊S 18.05±1.31 20.57±2.21 8.51±0.10ab116.98＊G2/M 19.84±2.11 16.18±0.62 9.93±1.82ab273.62＊

2.2.5 轉染后BMSCs增殖情況 除轉染1 d時各組MTT A490值差異無統(tǒng)計學意義外，之后其余時點轉染組MTT A490值均低于CON組和空載體組（均P＜0.05），CON組與空載體組比較差異均無統(tǒng)計學意義，見圖8。

Fig.8 The cell proliferation after transfection in three groups圖8 基因轉染后3組細胞增殖情況

3 討論

目前在基因轉染研究中應用較多的是質(zhì)粒載體和病毒載體[6-7]，本實驗從經(jīng)濟與安全角度考慮，采用非病毒載體作為外源性基因的表達載體即攜帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的質(zhì)粒用于轉染，基因測序結果顯示該序列正確插入質(zhì)粒載體pEGFP-N1中，構建的質(zhì)粒符合實驗設計標準。且行BMSCs瞬時轉染48 h后，轉染組轉染效率可達60％，認定轉染比較成功。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs在誘導劑作用下向神經(jīng)樣細胞分化過程中影響Notch信號通路相關基因和蛋白的表達[5]。為研究在Notch信號通路中具有重要作用的Notch1蛋白在BMSCs增殖分化中的作用，筆者通過構建Notch1（NICD）高表達質(zhì)粒，并轉染BMSCs從而達到Notch1胞內(nèi)段表達型增高，以探討這條信號通路起點的作用。結果發(fā)現(xiàn)，轉染48 h后，轉染組Notch1、GFAP基因相對表達量均明顯高于CON組和空載體組，空載體組與CON組無明顯差異，且各組間NSE基因表達也無明顯差異；Western Blotting的結果也與此一致。提示轉染NICD基因的BMSCs可能具有向神經(jīng)膠質(zhì)細胞誘導分化的傾向，而不具有向神經(jīng)元誘導分化的傾向。已有研究發(fā)現(xiàn)，高表達Notch信號具有向神經(jīng)膠質(zhì)化方向誘導的作用：（1）Notch的細胞內(nèi)結構NICD片段能直接活化GFAP啟動子[8]。（2）Notch蛋白通過Hes因子的作用間接或直接地促進星形膠質(zhì)細胞的生成[9]。（3）活化型轉錄調(diào)節(jié)因子（Ngn1、Ngn2、Ngn3等）參與皮質(zhì)祖細胞向神經(jīng)元的特化，但其缺少將使皮質(zhì)祖細胞變?yōu)樾切文z質(zhì)細胞[10]，而Notch蛋白的高表達具有抑制活化型轉錄調(diào)節(jié)因子的作用。以上研究推測，Notch胞內(nèi)信號活化，NICD轉運到細胞核與DNA結合蛋白CSL結合，可激活Hes基因表達，Hes表達水平增高可使Mash和Ngns活性降低，從而促進前體細胞向星形膠質(zhì)細胞分化。

BMSCs轉染48 h后，活細胞比率、早期凋亡率及晚期凋亡率與CON組和空載體組比較，轉染組存活細胞比率下降，早期細胞凋亡比率、晚期細胞凋亡比率均升高。MTT A490檢測發(fā)現(xiàn)，轉染組細胞生長曲線隨時間變化逐漸降低，而空載體組和CON組比較無明顯差異。同時，細胞一般狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)轉染后的BMSCs存在生存期較短的現(xiàn)象，這一方面可能由于轉染試劑的影響；另一方面可能由于存在高表達NICD使得Notch信號活化，有證據(jù)顯示，Notch信號活化可通過P53凋亡途徑誘導細胞的凋亡[11]，同時外源性活化Notch信號可以促使骨髓間充質(zhì)干細胞提前衰老，抑制細胞的增殖能力[12]。筆者推測轉染組細胞處于分化狀態(tài)，可能與Notch信號對多潛能干細胞的定向分化和自身復制具有決定性的調(diào)控作用有關。然而，目前這些研究多停留在神經(jīng)形態(tài)特征和神經(jīng)細胞標志物水平上，而缺乏生物學功能特性相關的證據(jù)，目前還沒有確切實驗能夠證明誘導后的神經(jīng)細胞具有神經(jīng)生理功能，因此許多學者將這類細胞稱為“神經(jīng)樣細胞”。

綜上所述，高表達Notch1（NICD）基因可以在一定程度上誘導BMSCs凋亡、抑制其增殖，且表現(xiàn)誘導向神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞分化趨勢。

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（2014-05-13收稿 2014-05-29修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Construction of Notch1(NICD)Eukaryotic Expression Vector and Its Influence on the Proliferation and Differentiation of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in vitro

DU Hongyang1,LI Dongning1，F(xiàn)U Haiyan2△,BAO Cuifen3,QIN Shujian3
1 Department of Dermatology,2 ICU in the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,3 Department of Anatomy, Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China△

E-mail：4197123@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of construct the Notch1(NICD)eukaryotic expression vector on the proliferation and differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in vitro.MethodsRat BMSCs were experimented as the object.NICD eukaryotic expression vector was constructed.pEGFP-N1-NICD expressing plasmids were used to transfect BMSCs.The study included control group(CON group),empty vector group(VEC group)and the transfection group(TRA group).After 48-hour transfection,BMSCs were observed for general morphology.The protein expressions of NSE,GFAP and Notch1 were detected by real-time PCR and Western blotting assay respectively.The apoptosis,cycle distribution and cell proliferation were evaluated by flow cytometry and MTT assay.ResultsThe DNA sequencing confirmed that the pEGFP-N1-NICD recombinant plasmid was successfully constructed,and both VEC group and TRA group expressed green fluorescence after 48-hour transfection.The relative expression levels of Notch1 and GFAP mRNA and protein were significantly higher in TRA group than those in VEC group and CON group(P＜0.05),and there was no significant difference between VEC group and CON group.After 48-hour transfection,the ratio of living cells was significantly lower in TRA group than that of CON group and VEC group,and the early apoptotic rate and late apoptotic rate were significantly higher in TRA group than those of CON group and VEC group(P＜0.05).The late apoptotic rate was significantly higher inVEC group than that of CON group.The proportion of G1/G0 cells was significantly higher in TRA group than that of CON group and VEC group,but S and G2/M cells were significantly lower(P＜0.05).The value of growth curve was gradually decreased in TRA group than that of CON group and VEC group(P＜0.05).ConclusionThe high expression of NICD gene might induce apoptosis of BMSCs,inhibit the proliferation in part,and induce into glial-like cell differentiation.

cell proliferation;cell differentiation;transfection;glial fibrillary acidic protein;phosphopyruvate hydratase;Notch signal pathway;bone mesenchymal stem cells;induction;Notch1(NICD)

R349.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.009

國家自然科學基金面上項目(31170930)；遼寧省科技廳自然科學基金計劃項目(2013022059)；遼寧醫(yī)學院青年科技啟動基金項目(Y2011Z010)

1遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院皮膚科（郵編121001），2重癥醫(yī)學科；3遼寧醫(yī)學院解剖學教研室

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